RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법
Summary
RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.
Abstract
높은 처리량 시퀀싱하고 효율적인 microarray 분석의 발전의 결과로서, 글로벌 유전자 발현 분석은 데이터 수집의 간편하고 쉽게 사용할 수 양식이되었습니다. 그러나 많은 연구와 질병 모델에서 대상 유전자 mRNA의 정상 상태 수준은 언제나 정상 상태 단백질 수준 상관 관계를하지 않습니다. 포스트 전사 유전자 조절은 둘 사이의 차이가 크다는의 가능성이 설명입니다. RNA 바인딩 단백질 (RBP)의 바인딩에 힘 입어 포스트 전사 규제 대상 mRNAs와 Ribonucleoprotein (RNP) 복잡한을 형성하여 mRNA의 현지화, 안정성 및 번역에 영향을 미칩니다. RNP 단지의 세포 추출물에서 이러한 알 수없는 드 노보 mRNA 목표를 확인하는 것은 이해 메커니즘과 RBP와 단백질 출력에서의 결과에 큰 영향을의 기능에 중요한 것입니다. 이 프로토콜은 s의 식별을 허용 RNP immunoprecipitation-microarray (RIP 칩)를 칭했다 방법을 설명추가로 개별 연구자에 대한 실험을 최적화하는 옵션과 함께 pecific mRNAs는 변화 실험 조건 하에서, ribonucleoprotein 단지에 연결된 상태입니다. 이 중요한 실험 도구, 연구자들은 후 전사 유전자 조절뿐만 아니라 다른 ribonucleoprotein 상호 작용과 관련된 복잡한 메커니즘을 탐색 할 수 있습니다.
Protocol
실험 준비 실험을 시작하기 전에, 모든 시약, 용기 및 주방기구 RNase 무료를하는 것이 중요합니다. DEPC – 처리 물과 린스 다음 RNase 억제제 (RNaseZAP, Ambion)로 유리를 취급합니다. 모든 시약은 RNase 무료로 확인되어 있는지 확인합니다. 1. mRNP Lysate 준비 성장하고 각 RIP에 대한 총 단백질 2-5 밀리그램 사이에 생산하기 위해 기하 급수적으로 성장 조직 세포를 수확. 두 P150 문화 요리는 일반적으로 충분합니다. 각 RBP이 조사되는 경우, 총 세포 수와 단백질 양이 적절한 대상 mRNA와 RBP 상호 작용을 극대화하도록 최적화해야합니다. qRT-PCR 분석을 위해 RIP는 특히 허, AUF1, TIAR와 같은 높은 풍부한 정보 RBPs위한 증폭 및 검출 방법에 의해 적은 세포 lysate를 (약 400 μg 총 단백질)이 필요할 수 있습니다. </ 리> 4에 8-10 분 ° C, 200 XG에서 원심 분리를 통해 펠릿 세포는 얼음 차가운 PBS로 세 번 씻어. 최종 세척 후, 부드럽게 RNase와 단백 분해 효소 억제제를 준비 polysome 용해 완충액 (PLB)의 동일한 볼륨에 튜브의 바닥에 resuspend 세포 펠렛을 버려야지. 그것은 세포 펠렛의 정확한 양을 측정하는 것이 좋습니다. 세포의 clumps을 분리 해제하고 5 분을 위해 얼음에 lysate을 배양하기 위해 조심스럽게 pipet 혼합 (소용돌이하지 않음). 4에 20 분에 13,000 XG에서 원심 분리기 ° C 파편의 lysate을 취소 할 수 있습니다. 즉시 미리 차가운 microfuge 튜브에 표면에 뜨는 삭제 전송할 수 있습니다. -80에서 얼음과 저장소에 보관 ° C. 즉시 냉동 세포의 적절한 용해를 완료하고 원치 않는 바인딩을 방지 할 수 있습니다. RIP 바로 아래의 예제 해동을 진행하고 RNA 저하를 방지하기 위해 얼음에 샘플을 보관. </ 리> 이 lysate는 -80에서 6 개월에 저장할 수 있습니다 ° C. 이 단백질 및 / 또는 mRNA 저하로 이어질 수 있으므로 반복 동결 해동 사이클을 피하십시오. 표준 브래드 포드 단백질 분석을 사용하여 lysate에서 단백질 농도를 Quantitate. 2. 항체 및 워시와 외투 단백질은 세 파로스 비즈 5 % BSA와 NT2 버퍼 (3-4 권)에서 하룻밤 사전 훌륭한 단백질 세 파로스 (PAS) 구슬. 4 ° C.에 저장 4에 몇 개월까지 장기 저장 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충하면 가능합니다. 단백질 세 파로스 비즈는 대상 RBP 항체의 isotype에 따라 선택해야합니다. 단백질 A, G 및 A / G 모두는 특정 isotype 목표를 가지고 대상 선호도에 따라 다양합니다. 단백질 세 파로스 비즈는 허 단백질 항체 isotype에 대한 특이성과 친화력을 바탕으로 사용되었습니다. 사용하기 전에, 그래서 초과 NT2 버퍼를 제거버퍼 비율 최종 구슬 1:1입니다. 1.5 ML RNAse 무료 microcentrifuge 튜브를 사용하여 PAS 슬러리 100 μl를 제거하고 각 개별 IP 반응 (즉, 특정 RBP 및 isotype 제어)에 대한 항체의 30 μg을 추가합니다. 항체 구슬 믹스에 NT2 버퍼의 100-200 μl를 추가합니다. 혼합은 4에서 몇 주 동안 저장 될 수 있습니다 ° C 0.1 % 나트륨 azide와 보충합니다. 같은 종의 isotype 검색 항체 또는 전체 일반 커는 배경 RNA에 대한 항체 제어로 병렬로 사용되어야합니다. 구슬 조합에 적절한 항체를 추가하고 4시에 끝으로 끝을 텀블링, 하루 아침에 품다 ° C. (항체 1, 5, 10 또는 30 μg 일반적으로 충분합니다) 조사중인 특정 단백질에 대한 항체 titer를 최적화 할 수 있습니다. 1 ML로 세척하여 바로 사용하기 전에 항체 코팅 구슬을 준비얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 5 회입니다. 4의 1-2 분 ° C.에 13,000 XG에서 원심 분리하여 구슬 믹스를 씻어 조심스럽게 손 pipettor 또는 흡인기로 supernantant의 최대 양을 제거하지만, 펠렛을 방해하지 않도록 할주의하십시오. 세탁은 항체 혼합물로부터 언 바운드 항체뿐만 아니라 RNase의 오염 물질을 제거하는 데 도움이됩니다. 일단 최종 세척이 완료되었습니다, 100 MM의 40 U / μl, 10 μl의 RNase의 10 μl 출력을 포함하여 대상 mRNAs를 보호하기 위해 다양한 RNase 억제제 치료에 이어 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼 700 μl의 구슬을 resuspend DTT, 15 μl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (15 ㎜). NT2 버퍼로 1,000 μl에 볼륨을 가져와. Vanadyl의 ribonucleoside 단지는 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 억제 효과로 인해 사용되지 않습니다. 3. Immunoprecipitation와 RNA 강수량 선택 Preclear 단계 : 배경을 줄이기 위해 구슬 및 제어 항체는 사전 투명한 lysate로 사용할 수 있습니다. 이 출력 신호를 줄일 수 있습니다. 이 단계는 microarray 다음 IP을 수행 할 때 배경을 줄이기 위해 필요할 수 있습니다. 그것은 일반적으로 qRT-PCR 다음 IP에 대한 필요가 없습니다. Preclear 30 분 / 4 끝 이상 ° C 텀블링 엔드에 대한 isotype 제어의 15 μg을 갖추고 있습니다. 단계 2.1에서 항체와 비 코팅 preswollen PAS 비즈의 50 μl를 추가합니다. 마지막 30 분 / 4 ° C 회전 엔드와를 품다 4 ° C.에서 10,000 XG에 원심 분리기 IP에 대한 표면에 뜨는 저장합니다. 준비된 항체 믹스로 분리 해제 lysate (약 2-5 MG) 100 μl를 추가합니다. lysate를 Diluting 것은 배경 및 특이 현상 구속력을 줄이기 위해 도움이 될 것입니다. lysate 입력 한 금액 검출 방법 및 RBP O의 풍부한에 따라 달라질 수 있습니다RBP 항체의 연구 효율은 단계 1.1.c.에 기록 (선택 사항) 즉시 부드럽게 4에 10,000 XG에서 간단한 원심 분리 한 다음 여러 번 flicking하여 튜브를 섞어 ° C 펠릿 구슬로 즉시 표준 RNA 절연 기술을 사용하여 qPCR 분석을위한 총 입력 mRNA 표현과 같은 표면에 뜨는 100 μl를 제거합니다. 이 단계는 입력 lysate RNA는 IP에 대한 최적입니다 만 검사 단계 또는 가난한 RNA 결과 RIP에 따라 문제 해결 단계로 수행해야합니다 확인하기위한 것입니다. parafilm의 랩 튜브 끝으로 끝을 텀블링 2 ~ 4 시간에 4에 꼭 씰링 및 배양 ° C를 보장합니다. 부화에 타이밍을 대상 풍부에 따라 최적화되어야하며 복잡한 다시 정리하기 또는 저하를 방지하기 위해 최소화되어야한다. 일부 RBPs를 들어 짧은 incubations 더 최적의 수 있습니다. 5000 xgf의 펠릿 비즈또는 4에서 5 분 ° C와 서양 얼룩에 의해 잠재적 인 분석을 위해 표면에 뜨는 저장합니다. -80에서 저장 aliquots ° C. 잔여 대상 단백질의 높은 양이있는 표면에 뜨는의 Aliquots는 세 파로스 구슬에 의해 유발되는 단백질의 실패를 나타낼 수 있습니다. 이전에 설명한 바와 같이, 얼음처럼 차가운 NT2 버퍼와 원심 분리 1 ML과 비즈를 다섯 번 씻어 (4에서 5 분 5,000 XG ° C)가 손 pipettor 또는 흡인기로 표면에 뜨는 제거합니다. 더 엄격한 세척 방법은 나트륨 deoxycholate, 우레아 또는 SDS와 NT2 버퍼를 보완하여 배경을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 얼음 최대한의 샘플을 유지하고 목표 mRNA의 저하를 최소화하기 위해 신속하게 작동합니다. 선택 사항 : 서양 얼룩 분석을 사용하여 대상 단백질의 IP 효율성을 확인을위한 비즈 믹스의 작은 나누어지는 (10 %)를 저장 또는 병렬로 추가 샘플을 실행합니다. 4. DNase와 Proteinase K 처리 세척 후, NT2 버퍼 100 μl와 resuspend 구슬은 RNase 무료 DNase 1 (2 U / μl)의 5 μl를 보충. 5-10 분 동안 37 ° C에서 보관. NT2 버퍼 1 ML을 추가하고 실온에서 1 분에 5,000 XG에 원심 분리기. 구슬의 작은 (~ 10 %) 나누어지는이 SDS-PAGE 분석하여 IP 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 100 μl NT2 버퍼, 5 μl Proteinase K (10 MG / ML), 및 1 μl 10% SDS에 Resuspend 펠릿 PAS. 부드럽게 매 10 분에서 flicking, 55 ° C 물 목욕시 30 분에 resuspended 비드 혼합물을 품다. Proteinase K는 RNP 구성 요소의 릴리스에 도움이됩니다. 5 실온 (RT)에서 분, 표면에 뜨는 (~ 100 μl)를 수집 5,000 XG에서 펠렛의 구슬. 구슬 200 μl NT2 버퍼 centri을 추가RT에서 2 분에 fuge 5,000 XG는 표면에 뜨는 (~ 200 μl) 및 폐기 비즈를 수집합니다. supernatants (100 μl와 200 μl)을 결합하고 산 페놀-CHCl 3 300 μl 낮은 레이어를 추가합니다. 소용돌이, 1 분 RT (또는 37 ° 흔드는에서 C) 및 1 분에 대한 RT에서 16,000 XG에서 원심 분리기. 상부 층 250 μl (인터페이스를 방해하지 마십시오)을 수집, 산도 5.2 625 μl 백퍼센트 ETOH 5 μl glycoblue에 25 μl 나트륨 아세테이트를 추가하고 잘 섞는다. -20 ° C.에서 하루 아침에 저장 RNA의 적절한 복구를 보장하기 위해 glycoblue의 추가는 캐리어 분자의 역할을하여 RNA 펠렛의 가시성을 높일 수 있습니다. 다음 날, 반전 3-5 배 혼합 튜브는 30 분 4에서 12,000 XG에서 스핀 ° C와 표면에 뜨는 폐기하십시오. 파란색 펠렛과 반전이나 vortexing하여 혼합에 70 % ETOH 1 ML을 추가합니다. 2 분에 대해 4 ° C에서 12,000 XG에 원심 분리기. 디표면에 뜨는을 iscard와 4에서 1 분에 12,000 XG를 원심 분리기 ° C. 5 분에 대한 RT에서 피펫, 공기 건조 펠릿과의 잔여 70 % ETOH를 제거합니다. RNase / DNase 무료 물이나 필요에 따라 다른 적절한 양의 20-40 μl에 Resuspend. 샘플는 현재 qRT-PCR 또는 microarray 등의 추가 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 준비가되었습니다. Nanodrop 분광 광도법은 샘플 농도를 평가에 사용될 수 있지만, 귀중한 샘플, 그건 낭비 상대적으로 부정확 할 수 있으므로 nanodropping 샘플을 피할 도움이 될 수 있습니다. 우리는 귀중한거나 낮은 항복 샘플에 대한 순도와 IP 효율성을 평가하는 하우스 키핑 유전자 성적 증명서를 정상화 샘플을하시기 바랍니다. 5. 대표 결과 프로 시저가 최적화 올바르게 수행 된 경우 immunoprecipitation는 mRNA 대상의 상당 농축를 얻을 수 있습니다. 일반적으로qRT-PCR에 의해 평가 때 50 배에 – RBP 및 mRNA 대상 (들)에 따라, 우리는 약 10 농축을 참조하십시오. RBPs 많은 타겟이 microarray 분석을 사용하여 실내 masse을 발견 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 qRT-PCR에 비해 저하에 더 민감하다. RBP에 따라 목표와 반응의 효율의 수는, microarray는 소설 대상 수백을 표시 할 수 있습니다, 또는 경우에만, 몇를 발견 할 수 있습니다. 예를 들어, 더 나은 특징 RNA 결합 단백질 허 중 하나 인 후 transcriptionally 여러 중요한 생리 유전자 1, 2의 표현과 번역을 규제하고있다. 유방암 세포 라인에 RIP 칩을 통해 허 – ribonucleo – 복합 절연 예를 들어, 그림 1에서와 같이 qRT-PCR을 사용하여 β-고를 포함한 여러 중요한 알려진 허 대상의 농축을 공개했다. 암 세포 라인 모두에서 β-고를는 12 풍부합니다 – 15 배에. 일반적으로 제대로 수행 할 때 우리는 큰 enr를 참조셀 라인의 다양한 β-고를의 ichment. RIP는 β-고를에 대한 상당한 이득을 공개하지 않는 경우에는이 RIP에 문제가 있음을 나타냅니다과 절차는 반복해야 할 수도 있습니다. 또한, 이러한 세포 라인에서 immunoprecipitated 샘플 microarray 분석은 다른 에스트로겐 수용체의 허 타겟의 독특한 표현 하위 집합 (ER) 등 ER 부정적 메가바이트-231 유방암 세포 라인 대 긍정적 인 MCF-7 암 세포가 그림 2 1 시연을 공개했다. 어느 관련된 암과 관련되지 않은 알려진 알 수없는 허 목표 :이 목표는 여러 범주로 나눌 수 있습니다. 예를 들어, CALM2과 CD9 모두 이전에 허 목표로 식별되지 않은 암 유전자 있습니다. 180 배는 허 단백질하고 이러한 목표 유전자 사이의 눈에 잘 띄는 상호 작용을 나타내는 허 펠릿에 풍부에 – qRT-PCR, CALM2과 CD9으로 microarray를 사용하고 확인은 5가된다는 것을 발견했다. <iMG SRC = "/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg"ALT = "그림 1"/> 1 그림. Immunoprecipitation 및 메가바이트-231에서 RIP (ER-)와 MCF-7 (ER +) 유방암 세포. Immunoprecipitations은 안티 – 허 단클론 항체 (3A2)와 IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 메가바이트-231 또는 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 3A2에 의해 감지로 허의 A. IP 서양이 예상 크기의 밴드를 공개했다. 오른쪽에있는 패널을로드하는 컨트롤과 같은 β-tubulin과 함께 두 세포 라인에서 사용 lysates 입력에 허의 양을 드러내고있다. 정량 RT-PCR에 의한 B. 검증은 각각 메가바이트-231과 MCF-7에서 3A2 된 IP에서 β-고를의 십오 및 11 배 enrichments, 알려진 허 대상을 보여 주었다. 모든 ΔΔCT 값은 GAPDH로 표준화되었다. 실험은 (N = 2) 중복 이루어했다. 그림 2. 허 RIP-칩은 ER + 및 ER-유방암 세포에 독특한 유전자 프로파일을 식별합니다.허의 immunoprecipitations는 메가바이트-231 또는 허 항체와 Illumina Sentrix 배열 (47,000 유전자)에 hybridized IgG1 isotype 컨트롤을 사용하여 MCF-7 세포 lysates에서 수행되었다. 제어 신호 차감되었습니다. 결과는 12 개의 배열의 누적 데이터를 나타냅니다. 실험은 일치 컨트롤 각 셀 라인에 대한 세중의 (N = 3)에서 수행되었다. 비늘이 log2 있습니다.
Discussion
본 실험, 최적화 및 경험의 특성으로 인해 성공적으로 의도 된 결과를 획득 할 수있는 유일한 보장 방법이 될 것입니다. 이 절차의 여러 단계에서 온도와 시약 및 제품의 효율적인 처리는 매우 중요합니다. 적절한 계획과 기법의 실행 실험이 권장하는 최적의 온도에서 적절한 기간에 수행 된 것을 보장하는 데 도움이됩니다. RNA의 분리 실험과 주요 문제는 RNases의 저하에 RNAs의 감도입니다. 모든 시약은 RNase 무료 저장하거나 RNase 무료 용기에 사용 있어야합니다. 이렇게하면 mRNA 샘플의 무결성을 보장에서 중요한 단계입니다. 실험이 제대로 수행 경우에도 그러나, 원하는 결과는 RBP 및 대상 mRNAs 사이의 상호 작용의 특성으로 인해 달성되지 않을 수 있습니다.
한 잠재적 인 문제가 낮거나 RIP 칩에 의해 고립 된 RNA로부터도없이 신호가 발생했습니다.총 RNA의 신호가 될 수 있지만,이 구슬 타고 내려 오게되고 불충분 한 바인딩 단백질의 결과 일 수 있습니다. 첫 번째 문제 해결 단계는 사용중인 휴대 전화 lysate의 특정 RBP의 적절한 표현을 가지고 있는지 확인하는 것입니다. 확인 후, 단백질은 최종 NT2 세척 한 후 격리 될 수 있으며 5 분에 Laemmli 버퍼 또는 다른 적절한 denaturing 버퍼에 resuspended 95에서 가열 ° C. 서양 얼룩 분석은 충분히 관련된 단백질의 풀다운 보장하기 위해 입력 lysate뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 조정에서 이러한 샘플을 사용할 수 있습니다.
또한, 셀을 lysing하면 이러한 구성 요소에 액세스하는 데 필요한 때문에, 일반적으로 분리 된 단백질과 mRNA 사이의 이상 및 원치 않는 상호 작용에 대한 가능성이 유입 될 수있다. 이러한 상호 작용은 잠재적으로 바인딩하고 특이 현상의 상호 작용을 통해 대상 mRNAs 또는 바인딩 단백질 "을 만끽"수 있습니다. 이러한 다양한 공동으로 또한, 단백질nditions는 여러 형태의 공간의 수와 바인딩을 모티브는 상호 작용을 방지, 그들의 목표 mRNAs에 액세스 할 수 없게 될 수 있습니다. 이 모두 효율적으로 작업뿐만 아니라 이러한 원치 않는 상호 작용을 제한하는 나와있는 최적의 온도를 활용의 중요성을 강화. 또한 각 특정 대상 단백질에 대한 조건을 세척의 최적화 상호 작용의 순도를 극대화하는 것이 중요합니다. 더 엄격한 세척 조건이 필요 할 수 있습니다. 예를 들어, 세탁 버퍼는 SDS 또는 신호 출력에 특이 현상 상호 작용과 배경을 줄이기 위해 요소의 적절한 금액을 보충 할 수 있습니다. 이 실험의 대상 RBP뿐만 아니라 독특한 생리적 조건에서 대상 mRNA에 완전히 의존 될 것입니다. 일부 조건은 샘플의 준비에 주목해야한다 특정 mRNA 분석 도구, 적합하지 않습니다.
마지막으로,하지만 RIP는 RNA의 농축에 성공- RBP 상호 작용, RIP (칩) 메소드와 잘 알려진 문제는 과도 mRNA 대상에 RBP의 특정 바인딩 도메인을 식별 할 수 없다는 것입니다. 여러 상호 연결 기술은 고유 한 시퀀스 목표를 분리하기 위해 RIP 뒤에 사용할 수 있지만, 단파 UV의 사용은 핵산 손상 될하는 경향이있다. PAR-CLIP, 또는 photoactivatable ribonucleoside의 crosslinking와 immuoprecipitation,로 알려진 새로운 방법은 안정적이고 과도 모두 RNA 상호 작용의 독특한 바인딩 사이트의 식별을 허용 초기 RNA에 thiouridine를 통합 할 수 긴 웨이브 UV을 사용합니다.
전반적으로, RIP 칩은 우리의 그룹뿐만 아니라 다른 많은 연구 그룹에 의해 RNA 결합 단백질과 mRNA 대상 사이의 상호 작용을 분리하고 공부하는 데 훌륭한 도구로 자리 매김하고 있습니다. 자연과 연습에 민감하지만,이 절차의 적절한 실행 최근까지 inacc되었습니다 이러한 RNP 단지의 고립을 얻을 것입니다발견 및 분석을위한 essible.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
국방부 (아이디어 상 W81XWH – 07-0406) – Ulus Atasoy로
NIH RO1 A1080870 – Ulus Atasoy로
NIH R21 A1079341 – Ulus Atasoy로
미주리 기관 자금 대학교 – Ulus Atasoy로
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M dithiothreitol | Fisher | BP172-5 | DTT |
| DNase 1 | Ambion | 2235 | RNase free |
| Ethylendiamine Tetraccetic Acid | Fisher | BP118-500 | EDTA |
| Glycogen | Ambion | 9516 | |
| 1 HEPES | Sigma | H3375-100G | pH 7.0 |
| Igepal Nonidet P-40 | USB | 78641 | NP40 |
| 1 M KCl | Fisher | BP366-500 | |
| 1 M MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| NT2 Buffer | *See Below | ||
| Polysome Lysis Buffer | *See Below | ||
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11873580001 | |
| Protein A Sepharose Beads | Sigma | P3391 | |
| Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
| RNase Out RNase inhibitor | Invitrogen | 10777-019 | 40 U/μl |
| 1 M NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher | BP166-500 | SDS |
| 1 M Tris-HCl | Fisher | BP153-500 | pH 7.4 |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | New England Labs | S1402S | VRC |
| Reagent Workup |
| Prepare reagents in RNase/DNase-free, DEPC-treated glassware |
| Polysome lysis Buffer |
| 100 mM KCl |
| 5 mM MgCl2 |
| 10 mM HEPES (pH 7.0) |
| 0.5% NP40 |
| 1 mM DTT |
| 100 units/ml RNase Out |
| 400 μM VRC |
| Protease inhibitor cocktail tablet |
| 5 ml of Polysome lysis buffer |
| Add 50 μl of 1 M HEPES (pH 7.0) |
| 500 μl of 1 M KCL |
| 25 μl of 1 M MgCl2 |
| 25 μl of NP40 |
| 4.7 ml RNase-DNase-free H2O |
| 50 μl of 1 M DTT |
| 12.5 μl of 100 U/ml RNase Out |
| 200 μl Protease inhibitor cocktail (dissolved according to manufacturer) |
| 10 μl 200 mM VRC (at time of use) |
| NT2 Buffer |
| 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) |
| 150 mM NaCl |
| 1 mM MgCl2 |
| 0.05% NP40 |
| 1 L of NT2 Buffer |
| 50 ml Tris (pH 7.4) |
| 30 ml 5 M NaCl |
| 1 ml 1 M MgCl2 |
| 500 μl NP40 |
| 820 ml RNase-DNase-free H2O |
Referencias
- Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).
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Dahm, G. M., Gubin, M. M., Magee, J. D., Techasintana, P., Calaluce, R., Atasoy, U. Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip. J. Vis. Exp. (67), e3851, doi:10.3791/3851 (2012).