RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

実験の準備実験を開始する前に、それはすべての試薬、容器や調理器具RNaseフリーを持っていることが重要です。 DEPC処理水ですすぎ、続いてRNaseインヒビター（RNaseZAP、Ambion社）を用いてガラス器具を扱う。すべての試薬はRNaseフリーであることが確認されていることを確認します。 1。 mRNPライセートを調製成長し、各RIPの総タンパク質の2-5 mgの間に生成するために指数関数的に成長している組織細胞を収穫します。 二つP150の培養皿で十分です。 調査されて各RBPは、総細胞数と蛋白質の量は、適切な標的mRNAとRBPの相互作用を最大化するために最適化する必要があります。 定量RT-PCR分析のために、RIPは、特に、HuRの、AUF1、TIARとして高いアバンダンスRBPs向けの増幅及び検出方法によるより少ない細胞溶解物（約400μgの総タンパク質）が必要な場合があります。 </ LI> 4 8〜10分間、200×gで℃で遠心分離によって細胞をペレット化し、次に、氷冷PBSで3回洗浄する。 最後の洗浄の後、静かにRNaseおよびプロテアーゼ阻害剤を用いてプリペアドポリソーム溶解バッファー（PLB）の等量チューブの底を再懸濁し、細胞ペレットをはじく。 それは、細胞ペレットの正確な体積を測定することをお勧めします。 氷上で5分間インキュベートした細胞溶解物の塊を分解するために静かにピペット混合（ボルテックスしないでください）​​。 4℃で20分間13000×gで遠心℃の破片のライセートをクリアする。 直ちに予冷微量遠心チューブに上清クリア移す。 -80℃で氷とストアを続ける℃まで即時凍結は細胞の適切な溶解が完了し、不要な結合を防ぐことができます。 RIPは直ちに次のサンプル雪解けを進め、RNAの分解を避けるために、サンプルを氷上で保管してください。</ LI> この溶解物を、-80℃で最大6ヶ月間℃に保存することができるこれはタンパク質および/またはmRNAの分解につながることができるように繰り返し凍結融解の繰り返しは避けてください。 標準Bradfordタンパク質アッセイを用いてライセート中のタンパク質濃度を定量する。 2。抗体およびウォッシュ付きコートタンパク質は、セファロースビーズ 5％BSAでNT2バッファー（3-4巻）中で一晩プレうねりプロテインAセファロース（PAS）をビーズ。 4℃で保存する 4℃で数ヶ月までの長期貯蔵℃の0.1％アジ化ナトリウムを補充した場合に可能です。 プロテインAセファロースビーズをターゲットRBP抗体のアイソタイプに基づいて選択されるべきである。タンパク質は、GおよびA / Gは、すべての特定のアイソタイプの目標を持ち、目標親和性が異なります。プロテインAセファロースビーズをHuRのタンパク質抗体のアイソタイプ特異性と親和性に基づいて使用されていました。 ご使用の前に、そう、過剰NT2バッファを削除バッファーの比率への最終的なビーズは1:1である。 1.5ミリリットルRNaseフリーのマイクロチューブを使用して、PASスラリー液100μlを削除して、個々のIP反応（ すなわち 、特定のRBPとアイソタイプコントロール）に対する抗体の30μgを追加します。 抗体ビーズミックスにNT2バッファ100〜200μlを添加する。 混合物を4℃で数週間保存可能℃の0.1％アジ化ナトリウムを補充したとき。 同じ種からのアイソタイプをマッチさせた抗体または全部正常血清は、バックグラウンド·RNAに対する抗体対照として並行して使用されるべきである。 ビーズミックスに適切な抗体を加え、一晩インキュベートし、4℃で端の上の端を、タンブリング℃に （抗体の1、5、10または30μgの通常十分です）を調べている特定のタンパク質に対する抗体価を最適化します。 1mlで洗浄することにより、使用直前に抗体被覆ビーズを準備氷冷NT2バッファー5回。 4℃で1〜2分℃、13,000 xgで遠心分離することによりビーズミックスを洗う慎重に手ピペッターまたはアスピレーターでsupernantantの最大量を削除するが、ペレットの中断を回避するように注意してください。 洗濯は、抗体混合物から未結合の抗体と同様のRNase汚染物質を除去するのに役立ちます。 最後の洗浄が完了した後、氷冷NT2バッファは100mMの10μlを、40 U /μLでRNaseを10μlの外を含む、標的mRNAを保護するためのさまざまなRNase阻害剤を用いた治療が続くの700μlのビーズを再懸濁DTTおよび15μlのEDTA（15 mM）を。 NT2のバッファーで1,000μlにボリュームを持ってきて。 バナジルリボヌクレオシド複合体は、EDTAの抑制効果があるため、使用されていません。 3。免疫沈降およびRNA沈殿オプションのプリ·クリアーの手順：バックグラウンドを低減するために、ビーズとコントロール抗体を事前クリアライセートに使用されるかもしれません。これにより、出力の信号を減​​少させることができる。 このステップでは、マイクロアレイに続くIPを実行するときにバックグラウンドを低減する必要があるかもしれません。これは、一般的に定量RT-PCRに続いてIPアドレスは必要ありません。 末に比べ30分/ 4℃タンブリングエンドのアイソタイプコントロール15μgの持つプリ·クリアー。 ステップ2.1から抗体と非被覆予め膨潤PASビーズの50μlを添加する。 末に比べ30分/ 4℃で回転端とをインキュベート 4℃、10,000×gで遠心分離しますIPのための上澄み保存します。 調製した抗体ミックスに隔離された清澄化ライセート（約2〜5 mg）の100μlを添加する。 ライセートを希釈して、バックグラウンドや非特異的結合を低減するのに役立ちます。 ライセート入力の量は検出方法及びRBP oの豊富さによって異なりますステップ1.1.c.で述べたように、RBP抗体のr効率 （オプション）直ちに静かに4℃、10,000×gで短時間の遠心分離に続いて数回タッピングしてチューブを混ぜ℃でペレットビーズへと直ちに標準RNA単離技術を用いた定量PCR解析のための総入力mRNAの表現として100μlの上清を除去します。 このステップでは、入力ライセートRNAがIPのための最適であり、唯一のチェックステップとして、または貧しいRNAの結果でRIPは、次のトラブルシューティングの手順として実行する必要があることを確認するためのものである。 パラフィルムでラップ管端の上の端を、タンブリング、2から4時間、4℃で密封し、インキュベート℃を確保する。 インキュベーション上のタイミングは、ターゲット豊富に基づいて最適化されるべきであり、複雑な転位または分解を避けるために、最小化されるべきである。一部RBPsに短いインキュベーションは、より最適かもしれません。 5000 XGFでペレットビーズまたは4°Cで5分とウェスタンブロット法によって潜在的な分析のために上澄み保存。 -80℃でアリコート℃で保存し残留標的タンパク質の多量と上清のアリコートは、セファロースビーズにより沈殿するタンパク質の障害を示すことがあります。 前述したように、氷冷NT2バッファと遠心分離（4℃で5分間5000 xgで℃）1mlのビーズを5回洗い、次にハンドピペッターまたはアスピレーターで上清を除去します。 より厳格な洗浄方法はデオキシコール酸ナトリウム、尿素やSDSとNT2のバッファを補充することにより、バックグラウンドを低減するために使用されるかもしれません。 できるだけサンプルを氷上で維持し、標的mRNAの分解を最小限に抑えるために迅速に作業。 オプション：ウェスタンブロット解析を用いた標的タンパク質のIP効率を確認するためのビーズミックスの少量（10％）を保存したり並列に追加のサンプルを実行します。 4。 DNaseおよびプロテイナーゼKトリートメント RNaseフリーのDNase 1（2 U /μl）を5μlのを補足したNT2の100μlの緩衝液で洗浄した後、再懸濁したビーズ。 5〜10分間37℃で保管してください。 NT2緩衝液1mlを加え、室温で1分間5000 xgで遠心分離します。 ビーズの小（〜10％）のアリコートをSDS-PAGE分析することによって、IP効率を確認するために用いることができる。 100μlのNT2バッファーに再懸濁し、PASペレットを、5μlのプロテ​​イナーゼK（10 mg / ml）を、および1μlの10％SDS。 穏やかに10分ごとにフリック、55℃の水浴中で30分間再懸濁したビーズ混合物をインキュベートする。 プロテイナーゼKは、RNPの成分の放出に役立ちます。 ペレットは、室温で5分間5000 xgで（RT）でビーズと（〜100μl）の上清を回収する。 遠心、ビーズに200μlのNT2のバッファを追加室温で2分間フーガ5000 XGは、上清（約200μl）を、廃棄ビーズを収集します。 上清（100μlと200μl）を組み合わせると酸フェノール- CHCl 3を 300μlの下位層を追加します。 渦、1分間RT（または37℃シェーカーのC）と1分間室温で16000×gで遠心分離してください。 上位層250μlの（インターフェイスを妨害することはありません）を採取し、pHは5.2、625μlの100％エタノールおよび5μlのglycoblueで25μlの酢酸ナトリウムを加え、よく混ぜる。 -20℃で一晩保存する RNAの適切な復旧を保証するために、glycoblueの添加は担体分子として作用することにより、RNAペレットの視認性を向上します。 反転による翌日、混合管3-5回、4で12,000 xgでスピン℃で30分間、上清を捨てる。 青いペレットと反転またはボルテックスに70％エタノール1 mlを加える。 2分間4℃で12,000×gで遠心します。 D上清をiscardと4℃で1分間、12,000×gで遠心する℃、 室温で5分間ピペットて空気乾燥してペレットと残留し、70％EtOHを削除します。 のRNase / DNaseフリー水または必要に応じて他の適切な体積の20〜40μlに再懸濁する。 サンプルは現在、そのような定量RT-PCRやマイクロアレイなどのさらに下流のアプリケーションの準備ができています。 光度計分光光度計は、試料濃度を評価する際に使用されるかもしれませんが、貴重なサンプルと、それはそれは無駄が多く、相対的に不正確になることができるようnanodroppingサンプルを回避するために有益であるかもしれません。我々は貴重なまたは低収量サンプルの純度およびIP効率を評価するために、ハウスキーピング遺伝子の転写産物に正規化サンプルを示唆している。 5。代表的な結果手順が最適化され、正しく実行されている場合は、免疫沈降は、標的mRNAの有意な富が得られるはずです。一般的に定量RT-PCRによって評価した場合、50倍に – 、RBPとそのmRNA標的（複数可）に応じて、我々は、約10の濃縮を参照してください。 RBPsの多くのターゲットは、マイクロアレイ解析を用いて一斉に発見することができます。しかし、この方法は、定量RT-PCRに比べて劣化の影響を受けやすくなります。 RBPは、ターゲットの数と反応の効率に応じて、マイクロアレイは、新規ターゲットの数百人を明らかにすることができ、または任意の場合にのみ、いくつかが明らかになることがあります。例えば、より良い特徴RNA結合タンパク質HuRのの一つは、転写後に多くの重要な生理的遺伝子1,2の発現および翻訳を調節する。乳癌細胞株において、RIP-チップ経由HuRの-ribonucleo複合体の分離は、例えば、 図1に示すように、定量RT-PCRを用いたβ-アクチンを含むいくつかの重要な既知のHuRのターゲット、の富を明らかにした。癌細胞株のβ-アクチンの両方に12を豊かにします – 15倍に。一般的に、適切に実行したとき、我々はかなりのENRを参照してください細胞株の様々なβ-アクチンのichment。 RIPは、β-アクチンの任意の有意な富を明らかにしない場合は、これは、RIPの問題を示していると手順を繰り返す必要があります。 図2 1に示されるように、さらに、これらの細胞株からの免疫沈降サンプルのマイクロアレイ解析は、異なるエストロゲン受容体におけるHuRのターゲット（ER）陽性のMCF-7癌細胞に対するER陰性のMB-231乳癌細胞株の異なる表現のサブセットを明らかにした。どちら関連や癌に関連付けられていない既知および未知のHuRのターゲット：これらのターゲットは、いくつかのカテゴリに分類されます。たとえば、CALM2とCD9は以前HuRのターゲットとして同定されなかった両方の癌遺伝子である。 HuRのタンパク質およびこれらの標的遺伝子との間に顕著な相互作用を示すHuRのペレットに富んで180倍に – マイクロアレイを使用しており、定量RT-PCRで確認し、CALM2とCD9は5であることがわかった。 <iMG SRC = "/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpgの" alt = "図1" /> 図1。免疫沈降およびMB-231でRIP（ER）およびMCF-7（ER +）乳癌細胞。免疫沈降は抗HuRのモノクローナル抗体（3A2）とIgG1アイソタイプコントロールを使用して、MB-231またはMCF-7細胞ライセートから行った。 3A2によって検出されるようなフルのA. IPウエスタン予想されるサイズのバンドを明らかにした。右側のパネルには、ローディングコントロールとして、β-チューブリンと、両細胞株から使用ライセート入力でHuRの量を明らかにする。定量的RT-PCR法によるBの検証はそれぞれMB-231およびMCF-7、3A2からIPSで、β-アクチンの15と11倍濃縮、既知HuRの目標を示した。すべてΔΔCT値をGAPDHに対して標準化した。実験は（n = 2）を二重に行った。 図2。 HuRのRIP-CHIPはER +とER-乳癌細胞内での個別の遺伝的プロファイルを識別します。HuRのの免疫沈降は、MB-231またはHuRの抗体とイルミナSentrixアレイ（47000遺伝子）にハイブリダイズしたIgG1アイソタイプコントロールを使用して、MCF-7細胞ライセートから行った。制御信号は差し引いた。結果は、12の異なるアレイからの累積データを表します。実験が一致するコントロールと各セルラインの三連（n = 3）の中で行った。スケールは、log2です。