מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים
Summary
שיטת בידוד של תאים ברשתית יחיד הגברה הבאות של cDNAs שלהם מתואר. מתא בודד transcriptomics מגלה את מידת ההטרוגניות הנוכחי הסלולר ברקמות ו חושף גנים סמן חדשים אוכלוסיות תאים נדירות. בפרוטוקול הנלווה יכול להיות מותאם כך שיתאים רבים סוגי תאים שונים.
Abstract
אוכלוסיות מאוד מיוחדים, אבל קטן מאוד של תאים ממלאים תפקידים חשובים ברקמות רבות. זיהוי תאים מסוג סמנים ספציפיים ביטוי הגן תוכניות תת תאים נדירים ביותר כבר אתגר משתמש רגיל כולו רקמות גישות. ביטוי גנים פרופיל של תאים בודדים מאפשר גישה חסרת תקדים סוגי תאים המרכיבים רק אחוז קטן של רקמה בסך הכל 1-7. בנוסף, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבחון את ביטוי הגן תוכניות באים לידי ביטוי זמני של מספר קטן של תאים במהלך מעברים התפתחותיים דינמיים 8.
בעיה זו של גיוון הסלולר עולה שוב ושוב במערכת העצבים המרכזית (CNS) שבו קשרים עצביים יכול להתרחש בין תאים שונים לגמרי 9. מספרם המדויק של תאים מסוגים שונים אינו ידוע במדויק, אך ההערכה היא כי ייתכנו כמה שרק 1000 סוגים שונים של קליפת המוח אניtself 10. הפונקציה (ים) של מעגלים עצביים מורכבים יכול לסמוך על כמה סוגי נוירונים נדירים הגנים שהם מבטאים. על ידי זיהוי סמנים חדשים וסיוע מולקולרי לסווג נוירונים שונים, הגישה מתא בודד שימושית במיוחד בניתוח של סוגי תאים במערכת העצבים. היא עשויה גם לעזור להבהיר מנגנוני ההתפתחות העצבית על ידי זיהוי גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי ושבילים גנים במהלך בשלבים המוקדמים של הפיתוח אבי העצבית.
כמו רקמה, פשוט לגשת בקלות עם מגוון עצבי ניכר, חוליות הרשתית היא מערכת מודל מעולה ללימוד תהליכי פיתוח הסלולר, בידול עצבית גיוון עצבי. עם זאת, כמו בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, זה הגיוון הסלולרי יכול להציג בעיה לקבוע את המסלולים הגנטיים המניעים אבות רשתית לאמץ גורל תאים ספציפיים, במיוחד לנוכח העובדה photoreceptors מוט לפצות את אמאjority של האוכלוסייה הכולל תא רשתית 11. כאן אנו מדווחים על שיטה לזיהוי של תמלילי לידי ביטוי בתאי רשתית יחיד (איור 1). הטכניקה מתחיל מתא בודד פרופיל מאפשר הערכה של כמות הנוכחי הטרוגניות בתוך אוכלוסיות סלולריים שונים של הרשתית 2,4,5,12. בנוסף, שיטה זו חשף שורה של גנים מועמדים חדשים אשר עשויים לשחק תפקיד (ים) את גורל התא תהליכי קבלת ההחלטות המתרחשים קבוצות משנה של ובתאים רשתית 8. עם כמה שינויים פשוטים לפרוטוקול, טכניקה זו יכולה להיות מנוצל על רקמות שונות סוגי תאים.
Protocol
Discussion
מספר המתרחבת של מחקרים חושפים שונות חזקים תא אל תא אוכלוסיות שנחשבו הומוגנית יותר מבחינת ביטוי הגנים שלהם 6,8. לפחות במקרה אחד, ביטוי הגן הזה "רעש" הוכח לשחק תפקיד ביולוגי חשוב 13. ביטוי גנים ההבדלים בין תאים בודדים הם הסתירו באמצעות מסורתיים כולו רקמות…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
Reaction mixtures:
Cell Lysis buffer
| 0.45 μ | 10X reaction buffer (100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 0.23 μl | 10% NP-40 |
| 0.23 μl | 0.1M DTT |
| 0.05 μl | RNase Inhibitor (40 U/μl) |
| 0.05 μl | SUPERase-In (20U/μl) |
| 0.13 μl | Modified Oligo d(T) primer (TATAGAATTCGCGGCCGCTCGCGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) |
| 0.09 μl | dNTPs (2.5 mM each) |
| 3.27 μl | dH20 (use molecular biology grade for all reaction mixtures) |
Tailing Reaction Mixture
| 0.18 μl | 100 mM dATP |
| 0.6 μl | 10X reaction buffer(100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 2 mM MgCl2) |
| 4.62 μl | dH2O |
| 0.3 μl | TdT (400 U/μl) |
| 0.3 μl | RNase H (2 U/μl) |
PCR Reaction Mixture
| 10 μl | 10x Ex-Taq HS Buffer with Mg2+ |
| 10 μl | 2.5 mM dNTPs |
| 0.2 μl | Modified Oligo d(T) primer (10 μg/μl) |
| 1 μl | Ex-Taq HS Polymerase (5U/μl) |
| 68.8 μl | dH2O |
10X One-Phor All Buffer
| 0.5M | Potassium acetate |
| 0.1M | Tris acetate (pH 7.6) |
| 0.1M | Magnesium acetate |
Solutions:
10X Phosphate buffered saline (1 liter)
80g NaCl
2g KCl
14.4 g Na2PO4
2.4 g KH2PO4
adjust to pH 7.4 with NaOH and bring the volume to 1 liter with water
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Vertical needle puller | David Kopf Instruments | Model 750 | |
| Microcapillary tubes | Sigma | P0674 | |
| Aspirator tube assembly | Sigma | A5177 | |
| Corning filter tips (100-1000 μl | Fisher Scientific | 07-200-265 | |
| Hank’s balanced salt solution (1X) | Lonza BioWhittaker | 10-508F | |
| HEPES buffer (1M) | MP Biomedicals | 091688449 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
| DNase I | Roche | 04716728001 | |
| papain | Worthington | LS03126 | |
| Superscript III | Invitrogen | 18080-044 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | AM2682 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| SUPERase-In | Applied Biosystems | AM2694 | These two RNase inhibitors seem to work the best. Contaminants present in other inhibitors can contribute to a background smear. |
| Modified Oligo d(T) primer (gel purified) | Oligos ETC | We have used primers purchased from many different companies and have seen the most reliable and reproducible results from Oligos ETC. | |
| T4 gene 32 protein | New England Biolabs | M0300L | |
| Exonuclease I | New England Biolabs | M0293S | |
| TdT | Roche | 3 333 574 | As with other reagents, using a TdT enzyme from other companies gave more variable results. |
| RNase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Ex-Taq HS Polymerase | Takara | RR006A | |
| Biotin N6-ddATP | Enzo Biosciences | 42809 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
Referencias
- Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
- Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
- Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
- Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
- Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
- Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
- Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
- Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
- Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
- Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
- Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
- Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
- Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
- Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
- Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
- Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
- Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
- Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
- Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
- McEvoy, J. F. -. O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
- Gelder, R. N. V. a. n. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
- Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
- Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
- Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).
