JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

Published: September 09, 2012
doi:
10.3791/3822
, ,
1Applied Bioscience Program, Faculty of Science,University of Ontario Institute of Technology , 2Nursing Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology , 3Medical Laboratory Science Program, Faculty of Health Sciences,University of Ontario Institute of Technology

Summary

هذه الدراسة توضح فحص صفيحة ميكروسكوبية الرواية التي تقيس النشاط FV تخثر تجلط الليفين خلال تشكيل في البلازما البشرية التي لم يبلغ عنها سابقا. أسلوب يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية باستمرار لقياس التغير في الامتصاصية في 405nm خلال تشكيل جلطة الليفين في البلازما البشرية.

Abstract

ردا على إصابة، يتم تنشيط تجلط الدم ويؤدي إلى جيل من تخثر الأنزيم البروتيني، ثرومبين. ثرومبين يشق الفيبرينوجين إلى الليفين الذي يشكل الجلطة التي توقف النزف غير قابلة للذوبان. عامل V (FV) في شكله المنشط، فعفا، هو عامل مساعد حاسم لXa النشط البروتيني والتسريع من خلال تشكيل جيل ثرومبين جلطة الليفين كجزء من بروثرومبيناز 1 و 2. وقد وصف دليل المقايسات FV 3، 4، لكنها تستغرق وقتا طويلا والذاتية. تم الإبلاغ عن المقايسات الآلي FV 5-7 و لكن المحلل والكواشف غالية الثمن وعادة ما توفر فقط في المرة الجلطة، وليس معدل ومدى تشكيل الليفين. ويفضل النظام الأساسي لقياس انزيم صفيحة ميكروسكوبية المحفزة الأحداث بسبب الراحة، والوقت والتكلفة والحجم الصغير، والرصد المستمر، والإنتاجية العالية 8 و 9. تم الإبلاغ عن المقايسات صفيحة ميكروسكوبية للتحلل الجلطة 10، تراكم الصفائح الدموية11، و 12 عوامل التخثر، ولكن ليس لFV النشاط في البلازما البشرية. وكان الهدف من طريقة لوضع مقايسة صفيحة ميكروسكوبية الذي يقيس النشاط خلال تشكيل FV الليفين في البلازما البشرية.

هذا الأسلوب صفيحة ميكروسكوبية الخطوط العريضة لرواية مقايسة بسيطة وغير مكلفة، والسريع للنشاط FV في البلازما البشرية. الفحص يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية لرصد التغير في الامتصاصية 405nm خلال تشكيل الليفين في البلازما البشرية (الشكل 1) 13. يقيس الفحص بدقة الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. أنها تتطلب سوى كميات ميكرولتر من البلازما، واكتمال في 6 دقائق، يحتوي على نسبة عالية الإنتاجية، حساسة إلى 24 80pM FV، ويقيس كمية غير قصد تنشيط (1-مرحلة النشاط) وثرومبين تنشيط FV (النشاط 2-مرحلة ) للحصول على تقييم كامل من نشاطها وظيفية مجموع (2-مرحلة النشاط – 1-مرحلة النشاط).

نشر intravascular التخثر (DIC) هو كغلوبثي المكتسبة التي غالبا ما يطور من العدوى موجودة من قبل 14. ويرتبط مع مدينة دبي للإنترنت بسوء التشخيص ومعدل وفيات أعلى من الزيادات علم الأمراض الموجودة سابقا 15. تم استخدام الفحص تبين أن المرضى الذين يعانون من في 9 مدينة دبي للإنترنت، وFV 1-المرحلة، المرحلة 2، ومجموع الأنشطة وانخفضت، في المتوسط، بنسبة 54٪، 44٪، و 42٪ على التوالي، مقارنة مع الإنسان العادي المجمعة إشارة البلازما (NHP).

الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قابل للتكيف بسهولة لقياس نشاط أي عامل التخثر. وهذا الفحص زيادة فهمنا للكيمياء الحيوية من خلال FV قياس أكثر من دقيقة وكاملة نشاطها في مجال البحث والمرافق الصحية. هذه المعلومات سوف تؤثر بشكل إيجابي على بيئات الرعاية الصحية من خلال التشخيص المبكر وتطوير علاجات أكثر فعالية لاضطرابات التخثر، مثل مدينة دبي للإنترنت.

Protocol

1. إعداد FV التي تعاني من نقص البلازما البشرية هذا الأسلوب هو تعديل للإجراءات المنصوص الأصلية كتبت بواسطة بلوم وآخرون 4. الحصول على دم الإنسان كله من المتطوعين البالغين الأصحاء بالتراضي (ذكر أو أنثى، 18 سنة – 50 سنة) التي لا تتخذ أي دواء. ارتداء قفازات مطاطية ومعطف المختبر في جميع أنحاء الداخلي. إعداد 100 مل من 3.2٪ (W / V) سترات صوديوم في الماء المقطر. تحميل 6.0 مل من هذا المحلول إلى 60 مل الحقن منفصلة. إزالة الهواء من قبل الغواص الاكتئاب بعناية لعلامة مل 6.0 على الحقنة. استخدام مسحة الكحول لتنظيف المنطقة من الوريد المرفقي بين بيسب والساعد. الاتصال 20 جهاز قياس فراشة لحقنة مل 3. إدراج إبرة في وريد فراشة المرفقي ولفت بلطف على المكبس حتى يملأ الدم إلى العلامة مل 3. تجاهل حقنة بالدم. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة أي عامل الأنسجة التي صدرت من البطانة التالفة في الإبرةموقع الإصابة التي قد تنشيط عملية التخثر وتتداخل مع إعداد FV التي تعاني من نقص البلازما. الاتصال إبرة الفراشة إلى 60 حقنة مل 'تحميل' سترات صوديوم مع 6.0 مل ورسم برفق على المكبس حتى يصل الدم علامة 60 مل على حقنة. (النهائي 10.9mM تركيز سترات). إزالة الإبرة من الحقنة فراشة وتخلط بلطف حقنة مع الحفاظ على إصبع الإبهام أو القفاز على منفذ حقنة. تواصل سحب الدم الى 60 مل كل ملء المحاقن مع 6.0 مل من سترات صوديوم 3.2٪ كما هو موضح أعلاه. ينبغي للمرء أن يتوقع انتعاش بنسبة 50٪ تقريبا من حجم الدم والبلازما ستراتي بعد الطرد المركزي والمطلوب 50 ميكرولتر من FV التي تعاني من نقص البلازما في عينة الفحص في صفيحة ميكروسكوبية. مختبرنا العمليات بشكل روتيني 300-420 مل من الدم في وقت ستراتي باستخدام المحاقن 5-7 × 60 مل كل مع 6.0 مل من سترات صوديوم 3.2٪ / حقنة. هذا يكفي FV التي تعاني من نقص البلازما لحوالي 3،000 الصغرىالمقايسات لوحة (انظر أدناه). إزالة الإبرة من ذراع فراشة المتطوع والضغط على الشاش المعقم على موقع ثقب الوريد ل 1.0 دقيقة. تغطية موقع ثقب الوريد بضمادة معقمة. أجهزة الطرد المركزي في الدم ستراتي 3300 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استعادة طبقة البلازما العليا الأصفر إلى كوب من البلاستيك مع قضيب تحريك باستخدام ماصة نقل البلاستيك مع الحرص على عدم إزعاج أقل لخلايا الدم الحمراء والبيضاء طبقة. حجم البلازما في مقياس مل والاحتفاظ 100 ميكرولتر من EDTA البلازما قبل الجمع على الجليد لمستقبل البروثرومبين الوقت تجلط (PT) اختبار (انظر أدناه). إضافة ببطء EDTA الصلبة لسيتراتي البلازما مع التحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة لتحقيق 5MM (تركيز النهائي). مرة واحدة في EDTA قد حلت، وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم 1.0M نقطه نقطه من لطيف مع التحريك. تغطية الكأس مع التفاف ساران واحتضان لمدة 8-10 ساعة دون اثارة في 37 ° C. كل ساعة 2، استرجاع 100 ميكرولتر منالبلازما EDTA المعاملة على الجليد وتحديد PT في وقت الحضانة مع EDTA وقارن بين حزب العمال من البلازما بالإضافة إلى ذلك قبل EDTA (انظر أعلاه). لقرارات PT، مكان قابل للإزالة 8 شرائط immunomodule جيدا في قالب من البلاستيك وحامل إدراج في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. شرائط immunomodule الشرق في قارئ صفيحة ميكروسكوبية على النحو التالي:، فارغة فارغة، عينة،، فارغة فارغة، عينة، فارغة، وفارغة من اليسار إلى اليمين في قالب حامل للتقليل من التدخل ضوء مبعثر من عينة المجاورة التي تحتوي على شرائط. أيضا، لا تستخدم سوى آبار 2-7 من الأعلى إلى الأسفل في كل قطاع 8 immunomodule جيدا لتقليل ضوء التدخل مبعثر من حواف القالب حامل البلاستيك. الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قادر على قياس الليفين تشكيل جلطة في ما لا يقل عن 12 عينة مختلفة في نفس الوقت (6 عينات في قطاع immunomodule على شرائط immunomodule 2). باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 50 ميكرولتر من HBS (HEPES 20MM، 150mM كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) إلىكل صفيحة ميكروسكوبية جيدا لأن يعاير كل من العينة. باستخدام ماصة واحدة، إضافة 50 ميكرولتر من الإنسان العادي البلازما المرجعية المجمعة (NHP) أو البلازما قبل إضافة EDTA أو في أوقات مختلفة بعد إضافة الحضانة EDTA لفصل صفيحة ميكروسكوبية الآبار. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة 50 ميكرولتر ثرومبوبلاستين (انظر أدناه للحصول على طريقة إعداد) لجميع الآبار صفيحة ميكروسكوبية مع البلازما إلى أن يعاير. احتضان في قارئ صفيحة ميكروسكوبية C ° 25 لمدة 1 دقيقة وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لوحة ثانية خلال 15-25 دقيقة من الحضانة 1. استخدام الكمبيوتر وتفاعل مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية، والوصول SoftMax برو تطبيق البرمجيات صفيحة ميكروسكوبية. تعيين القارئ إلى امتصاص، والطول الموجي 405nm ل، لوضع درجة الحرارة، والحركية إلى 25 ° C، وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لمدة 5 ثوانى، وقراءة الامتصاصية في كل ثانية 405nm 5 ل6 دقائق. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة كلوريد الكالسيوم (50 ميكرولتر من الماء المقطر 25mm في؛ 2.1mM الاتحاد الدولي للسباحةتركيز L) لجميع الآبار صفيحة ميكروسكوبية، انتظر 15 ثانية، ثم اضغط على "بدء" رمز في القائمة صفيحة ميكروسكوبية برو SoftMax لبدء الفحص. تحديد المواد السمية الثابتة من ملامح الامتصاصية مقابل مرة وبرو كما SoftMax الوقت للوصول إلى الزيادة القصوى في 1/2 الامتصاصية في 405nm (نقطة منتصف لامتصاص السيني مقابل منحنى الزمن المنتجة بعد تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد انظر أدناه، الشكل 1). حساب المرحلة 1-FV النشاط من دخول الوقت كلوت (ثانية) مقابل نشاط FV دخول (وحدة / مل) كما هو موضح أدناه في الشكل 2A. لأغراض تحديد الكميات، ويعرف 1Unit النشاط FV كما الحاضر في 1.0 مل النشاط NHP قبل تفعيل المتعمدة التي ثرومبين المضافة (انظر أدناه، يعاير عينات البلازما البشرية مع FV 1-2-مرحلة ومرحلة الفحص تخثر صفيحة ميكروسكوبية). إعداد 4.0L من HEPES 20MM تحتوي على كلوريد الصوديوم 0.15M في الماء المقطر مع التحريك لطيف. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع dropw بطيئةISE إضافة هيدروكسيد الصوديوم 5.0M (HBS، ودرجة الحموضة 7.4). الحصول على مدة كافية من أنابيب غسيل الكلى وشطف جيدا بالماء المقطر. عقدة التعادل في واحدة من نهاية الأنبوب. نقل EDTA المعالجة البلازما لأنابيب غسيل الكلى مع ماصة نقل البلاستيك، وإزالة الهواء، وربط عقدة في الطرف الآخر من الأنبوب. شنق بعناية البلازما EDTA المعاملة في الأنبوب في HBS مع التحريك لطيف. تغطية مع لفاف ساران وdialyze ل16H-14 مع التحريك لطيف في C. ° 4 إزالة بعناية البلازما EDTA-treated/dialyzed في مليلتر مأخوذة 3،0 حتي 15،0 مل أنابيب المسمار توج والاحتفاظ 100 ميكرولتر لفحص PT من 'النهائية' التي تعاني من نقص البلازما FV على الجليد. تخزين البلازما FV التي تعاني من نقص في في -80 ° C حتى الاستخدام. وفقا للشروط المذكورة أعلاه، وزيادة المواد السمية الثابتة 10-15 ثانية قبل إضافة EDTA ل90-100 8-10 ساعة بعد إضافة ثانية EDTA. البلازما FV التي تعاني من نقص هذه الطريقة التي أعدتها يحتوي عادة أقل من 0.1٪ من الحاضر FV نشط في البدايةالبلازما الطازجة الإنسان. 2. إعداد ثرومبوبلاستين مطلوب غسيل الكلى لإزالة أي الكالسيوم من هذا الكاشف من أجل السماح بالتحديد جلطة الليفين تشكيل توقيت من وقت إضافة كلوريد الكالسيوم لبدء عملية التخثر. إعداد 100 مل و4.0L من HEPES 20MM وكلوريد الصوديوم 0.15M في الماء المقطر في دورق البلاستيك مع التحريك لطيف. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع اضافة نقطه نقطه من هيدروكسيد الصوديوم 5.0M بطيئة (HBS، ودرجة الحموضة 7.4). إضافة 6.0 مل من HBS، ودرجة الحموضة 7.4 إلى القنينة الواحدة من كاشف ثرومبوبلاستين، استبدال الغطاء، ويهز بلطف إلى حل. احتضان كاشف في قارورة توج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة المواد المجففة. يهز بلطف بحل تماما. قطع بطول كاف من أنابيب غسيل الكلى، وشطف جيدا بالماء المقطر، وربطة عنق من أحد طرفي الأنبوب مع عقدة. نقل إلى أنابيب ثرومبوبلاستين غسيل الكلى، وإزالة الهواء، وربط قبالة الطرف الآخر من الأنبوب مع عقدة. CAشنق refully أنابيب غسيل الكلى في 4.0L من HBS، ودرجة الحموضة 7.4 اثارة بلطف التفاف ساران مغطاة في C ° 4 ل14-16 ساعة. نقل 3،0 مليلتر مأخوذة من ثرومبوبلاستين مدال إلى 15 مل أنابيب المسمار توج وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى استخدامها. 3. إعداد FV التخثر صفيحة ميكروسكوبية 1-مرحلة الفحص المنحنيات القياسية نشاط ذوبان الجليد FV التي تعاني من نقص البلازما، NHP، وتجلط الدم في C ° 37 لمدة 10 دقيقة. المزيج بلطف FV التي تعاني من نقص البلازما وتجلط الدم بشكل مستقل، ونقل إلى فصل البلاستيك صواني الغسيل، واحتضان على الجليد. تخزين NHP على الجليد بعد خلط بلطف. متجر كلوريد الكالسيوم (25mm في الماء المقطر) في علبة غسيل منفصلة في درجة حرارة الغرفة. إعداد 200 ميكرولتر كل من 2 أضعاف التخفيفات مسلسل NHP من 0 -، 2 -، 4 -، 8 -، 16 -، 32 -، 64 -، 128 -، 256 -، 512 أضعاف في HBS، درجة الحموضة 7.4 باستخدام 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. دوامة جيدا واحتضان على الجليد. وضع قابل للإزالة 8 شرائط immunomodule جيدا في عlastic حامل قالب وإدراج في قارئ صفيحة ميكروسكوبية. شرائط immunomodule الشرق في قارئ صفيحة ميكروسكوبية على النحو التالي:، فارغة فارغة، عينة،، فارغة فارغة، عينة، فارغة، وفارغة من اليسار إلى اليمين في قالب حامل للتقليل من التدخل ضوء مبعثر من عينة المجاورة التي تحتوي على شرائط. أيضا، لا تستخدم سوى آبار 2-7 من الأعلى إلى الأسفل في كل قطاع 8 immunomodule جيدا لتقليل ضوء التدخل مبعثر من حواف القالب حامل البلاستيك. الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قادر على قياس الليفين تشكيل جلطة في ما لا يقل عن 12 عينة مختلفة في نفس الوقت (6 عينات في قطاع immunomodule على شرائط immunomodule 2). تشغيل قارئ صفيحة ميكروسكوبية والوصول SoftMax تطبيق صفيحة ميكروسكوبية برو البرمجيات. باستخدام ماصة الأقنية، وجعل وقت واحد من الإضافات التي تعاني من نقص البلازما FV (50 ميكرولتر) إلى جميع صفيحة ميكروسكوبية عينة الآبار. استخدام ماصة واحدة، إضافة 50 ميكرولتر من التخفيفات المسلسل من 10 NHP استعداد لفصل صفيحة ميكروسكوبية فوق الآبار. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة ثرومبوبلاستين (50 ميكرولتر) إلى جميع الآبار العينة. في احتضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية 25 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لوحة ثانية خلال 15-25 دقيقة من الحضانة 1. استخدام الكمبيوتر وتفاعل مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية، والوصول SoftMax برو تطبيق البرمجيات صفيحة ميكروسكوبية. تعيين القارئ إلى امتصاص، والطول الموجي 405nm ل، لوضع درجة الحرارة، والحركية إلى 25 ° C، وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لأول 5 ثوانى بعد إضافة كلوريد الكالسيوم، والامتصاصية في مقياس 405nm كل ثانية (5) ل6 دقائق بعد ذلك. لا يتم تضمين الفاصلة ثانية 5 مرات في تهتز جلطة حساب (انظر أدناه). باستخدام ماصة الأقنية، إضافة كلوريد الكالسيوم (50 ميكرولتر من الماء المقطر 25mm في، تركيز النهائي 3.5mM) لجميع الآبار عينة صفيحة ميكروسكوبية، انتظر 15 ثانية، اضغط على "بدء" رمز في التطبيق صفيحة ميكروسكوبية في برو SoftMax من جهاز الكمبيوتر لبدء مقايسة. Tوتحسب انه جلطة مرات ومرة ​​ثانية في الوصول إلى نقطة الوسط بين الامتصاصية الأدنى والأقصى في 405nm بعد تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد. يتم حساب المعدلات الأولية لتشكيل جلطة حيث إن معدل الزيادة في الامتصاص في 405nm (mUnits / دقيقة) التي تشمل أول مرة نقاط 5 من تشكيل جلطة في الجزء خطية من المنحنى الامتصاصية مقابل الوقت. تم حساب مدى تشكيل جلطة على أساس الفرق بين الحد الأدنى والحد الأقصى الامتصاصية في 405nm (وحدات) التي تحققت خلال هذا الحدث تشكيل الجلطة. 4. يعاير عينات البلازما البشرية مع FV 1-2-مرحلة ومرحلة الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية ذوبان الجليد FV التي تعاني من نقص البلازما، NHP، البلازما العينة، وتجلط الدم في C ° 37 لمدة 10 دقيقة. المزيج بلطف FV التي تعاني من نقص البلازما وتجلط الدم بشكل مستقل، ونقل إلى فصل البلاستيك صواني غسل ELISA، واحتضان على الجليد. تخزين البلازما NHP وعينة على الجليدبعد خلط بلطف. متجر كلوريد الكالسيوم (25mm في الماء المقطر) في علبة منفصلة غسل ELISA في درجة حرارة الغرفة. إعداد 200 ميكرولتر كل من 40 أضعاف التخفيفات من البلازما وNHP العينة في مسح ميزانية الأسرة، درجة الحموضة 7.4 1.5 باستخدام أنابيب microcentrifuge مل. دوامة جيدا واحتضان على الجليد. إدراج القابلة للإزالة 8 شرائط immunomodule جيدا في قالب من البلاستيك وصاحب تضاف الى قارئ صفيحة ميكروسكوبية. شرائط immunomodule بديل، فارغة فارغة، عينة، فارغة، فارغة، عينة، فارغة، وفارغة من اليسار إلى اليمين في قالب حامل للتقليل من التدخل ضوء مبعثر من عينة المجاورة التي تحتوي على شرائط. فقط استخدام الآبار 2-7 من الأعلى إلى الأسفل في كل قطاع immunomodule للحد من التدخل ضوء مبعثر من حواف القالب حامل البلاستيك. تشغيل قارئ صفيحة ميكروسكوبية والوصول SoftMax تطبيق صفيحة ميكروسكوبية برو البرمجيات. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة FV التي تعاني من نقص البلازما (50 ميكرولتر) إلى جميع صفيحة ميكروسكوبية عينة الآبار. باستخدام سينغله ماصة، إضافة 50 ميكرولتر من 40 أضعاف NHP المخفف أو البلازما عينة أعدت فوق صفيحة ميكروسكوبية لفصل الآبار. باستخدام ماصة الأقنية، إضافة ثرومبوبلاستين (50 ميكرولتر) إلى جميع الآبار العينة. في احتضان قارئ صفيحة ميكروسكوبية 25 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لوحة ثانية خلال 15-25 دقيقة من الحضانة 1. استخدام الكمبيوتر وتفاعل مع قارئ صفيحة ميكروسكوبية، والوصول SoftMax برو تطبيق البرمجيات صفيحة ميكروسكوبية. تعيين القارئ إلى امتصاص، والطول الموجي 405nm ل، لوضع درجة الحرارة، والحركية إلى 25 ° C، وبرنامج قارئ صفيحة ميكروسكوبية لزعزعة لأول 5 ثوانى بعد إضافة كلوريد الكالسيوم، والامتصاصية في مقياس 405nm كل ثانية (5) ل6 دقائق بعد ذلك. لا يتم تضمين الفاصلة ثانية 5 مرات في تهتز جلطة حساب (انظر أدناه). باستخدام ماصة الأقنية، إضافة كلوريد الكالسيوم (50 ميكرولتر من الماء المقطر 25mm في، تركيز النهائي 6.25mM) لجميع الآبار صفيحة ميكروسكوبية عينة والعلاقات العامة على الفوروفاق سطيف على "بدء" رمز في التطبيق صفيحة ميكروسكوبية في برو SoftMax من جهاز الكمبيوتر لبدء الفحص. في نهاية المدى، وتحديد الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة لمدة 40 أضعاف NHP المخفف والبلازما عينة من ملامح الامتصاصية مقابل الوقت في برو SoftMax. مع مراعاة التخفيف 40-أضعاف، استخدم وقت تجلط لكل عينة لحساب النشاط FV في وحدة / مل من FV 1-مرحلة منحنى النشاط القياسي للوقت دخول كلوت مقابل سجل النشاط FV (الشكل 2A). هذا النشاط يمثل FV-1 المرحلة أو أنه من دون تفعيل "المتعمد" من قبل ثرومبين. منذ يتم تنشيط FV مع الثرومبين إلى العامل المساعد النشط، فعفا 1، الفحص الثاني بعد الجمع والحضانة مع ثرومبين أمر بالغ الأهمية لقياس بدقة 2-FV مرحلة النشاط لعينة البلازما (مع تفعيل "المتعمد" من قبل ثرومبين مضاف). لمقايسة 2-FV المرحلة، وإعداد 200-300 ميكرولتر من 18 ألف تنقية ثرومبينر 100nM في HBS، ودرجة الحموضة 7.4 احتضان على الجليد. تخطط لاستخدام 10 ميكرولتر من ثرومبين المخفف لكل عينة البلازما إلى أن يعاير مع مقايسة 2-FV المرحلة. تمييع 120 ميكرولتر من NHP أعلاه ونموذج من البلازما أضعاف أضعاف ل-40-100 مع 170 ميكرولتر من HBS، درجة الحموضة 7.4 تحتوي على كلوريد الكالسيوم 2.8mM. إضافة 10 ميكرولتر الثرومبين (10nM تركيز النهائي) إلى كل عينة. دوامة جيدا لخلط واحتضان عند C ° 37 لمدة 1 دقيقة. تمييع NHP والبلازما عينة لأضعاف-500 عن طريق إضافة 400 ميكرولتر من HBS، ودرجة الحموضة 7.4، دوامة جيدا، وفحص 50 ميكرولتر من كل عينة البلازما في FV 1-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية كما هو موضح أعلاه. تحديد الوقت لجلطة NHP وكل عينة البلازما يعاير من ملامح الامتصاصية مقابل مرة وSoftMax برو. مع مراعاة التخفيف 500-أضعاف، استخدم وقت تجلط لكل عينة لحساب FV 2-مرحلة من النشاط 1-FV مرحلة منحنى الزمن كلوت مستوى دخول سجل النشاط مقابل FV (الشكل 2A). مجموع FV األنشطةثم قد يكون حساب والمتوفرة من النشاط 2 المرحلة FV – 1-FV مرحلة النشاط.

Representative Results

ممثل النتائج – اعداد FV 1-مرحلة الفحص تخثر منحنيات معيار النشاط صفيحة ميكروسكوبية ويتضح من الأمثلة ممثل تشكيل جلطة الليفين في مقايسة مع مرور الوقت FV التي تم إنشاؤها بواسطة قارئ صفيحة ميكروسكوبية في الشكل 1. الفحص يقيس بدقة FV الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. التفتيش على الآبار بعد استكمال الفحص أكد أن تشكيل جلطة حدث. وصلت جميع ردود الفعل بنفس الدرجة تقريبا من تشكيل جلطة مع تغيير عام في الامتصاصية في 405nm من 0،35 حتي 0،45 الوحدات بين الامتصاصية بدأت قبل وبعد الامتصاص القصوى تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد. أمثلة ممثل FV منحنيات النشاط 1-مستوى المرحلة من الزمن كلوت دخول (في ثانية) مقابل نشاط FV دخول (وحدة / مل) و تسجيل قيم الأولي لتشكيل الجلطة (في mUnits / دقيقة) في مقابل نشاط FV دخول (وحدة / مل ويرد) لالتخفيفات المسلسل من NHP في <stronز> الشكل 2A و 2B الشكل، على التوالي. تركيب مؤامرة دخول سجل الزمن، كلوت مقابل FV أشارت 1-نشاط علاقة قوية بين هذه المتغيرات بعد تحليل الانحدار الخطي (2A الشكل؛ R 2 = 0.980). تركيب مؤامرة دخول دخول لل-قيم الأولي لتشكيل الجلطة مقابل نشاط FV أشار أيضا إلى وجود علاقة قوية بين هذه المتغيرات بعد تحليل الانحدار الخطي (الشكل 2B، R 2 = 0.983). ظلت العلاقة بين كل من سجل الزمن كلوت و تسجيل قيم الأولي لتشكيل الجلطة مقابل سجل النشاط FV الخطية لNHP مخففة تصل إلى أضعاف-512. منذ FV يدور في NHP في الساعه 12-40nM 16، صفيحة ميكروسكوبية الفحص حساس لحوالي 24 80pM FV في NHP. بالنظر إلى أن التفكك المستمر للتفاعل دهون، فعفا-FXA في بروثرومبيناز حوالي 1nM 17، الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV هو مناسبة تماما لقياس مستويات FV في الناحية الفسيولوجية وrelevanر مجموعة نانومتر من أجل وظيفة في فعفا بروثرومبيناز. باستخدام مقايسة صفيحة ميكروسكوبية FV، تقرر أيضا أن المعدل الطبيعي للنشاط في نشاط FV FV مقايسة 1-مرحلة البلازما من 15 مراقبة صحية (ذكر وأنثى، العمر 18-من 20yrs) كان (يعني ± الانحراف المعياري؛ المدى): 0،96 ± 0.14U/ml؛ 0.68-1.11U/ml. هذا يتفق تماما مع النشاط FV صحية طبيعية ومجموعة (0.66-1.14U/ml) التي أبلغت عنها كاتلر وآخرون. لFV 1-مرحلة النشاط تحدد مع محلل الآلي 7. كان التباين داخل الفحص لمدى والوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في 6 آبار في 8 أيام مختلفة 3.4٪، 4.4٪، و 3.1٪، على التوالي. كان التباين بين الفحص لمدى والوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في 6 آبار من 8 تجارب مختلفة في 8 أيام مختلفة 7.1٪، 7.8٪، و 9.2٪، على التوالي. وهكذا، فإن التباين داخل وفيما بين هذه مقايسة-3 measuوكان الأحمر المتغيرات على مستوى منخفض ومقبول للحصول على أداء قوي الفحص داخل وبين صفيحة ميكروسكوبية فحص عينات متعددة في نفس الوقت (حتى 12). ممثل النتائج – يعاير عينات البلازما البشرية مع FV 1-2-مرحلة ومرحلة الفحص تخثر صفيحة ميكروسكوبية تم استخدام منحنى مستوى نشاط دخول كلوت مقابل الزمن FV دخول (الشكل 2A) لقياس النشاط في NHP FV و 9 البلازما المريض DIC التي لم يتم تنشيط عمدا مع الثرومبين المضافة (FV 1-مرحلة النشاط) أو تم تنشيط عمدا مع وأضاف الثرومبين (2-FV مرحلة النشاط) وتظهر النتائج في الجدول 1. عرض جميع 9 البلازما المريض DIC 1-FV المرحلة الأنشطة والمعدلات الأولية لتشكيل الجلطة التي انخفضت في المتوسط، بنسبة 54٪ و 18٪، على التوالي، من NHP. كانت بدرجات من تشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV في المرضى DIC لا تختلف إلى حد كبير من NHP، وزيادة في المتوسط، بنسبة 13٪ من NHP. ولدت تفعيل NHP مع الثرومبين تقريبي 8-أضعاف الزيادة في FV 2-مرحلة النشاط فوق النشاط 1-FV المرحلة (الجدول 1). هذا يشير إلى أن FV في NHP كان حاضرا بشكل رئيسي في شكله unactivated وتتفق مع النتائج المعلنة سابقا باستخدام دليل الخيمة أنبوب المقايسات FV 3 و 4 و المقايسات الآلي FV 5-7. وانخفضت أيضا 2-FV المرحلة والنشاط مجموع المرضى في مدينة دبي للإنترنت في المتوسط، بنسبة 44٪ و 42٪، على التوالي، من NHP. كانت المعدلات الأولية وبدرجات من تشكيل جلطة في FV 2-مرحلة الفحص في المرضى DIC لا يختلف كثيرا عن NHP، واختلفت في المتوسط، من٪ 9 تقريبا و 4٪ على التوالي، من تلك التي لوحظت مع NHP. وأشارت هذه النتائج أنه بالمقارنة مع FV في NHP، وFV في البلازما المريض DIC أدى في وقت لفترات طويلة وانخفاض معدل تكوين جلطة الليفين وأن المريض كان FV في المتوسط، 56٪ فقط كما activatable مع الثرومبين أيضا. الأنف والحنجرة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 1. تشكيل الجلطة العادية في تجميع البلازما قياس مرجعية الإنسان مع FV صفيحة ميكروسكوبية الحركية 1-مرحلة الفحص التخثر. تم رصد مستمر الليفين تشكيل جلطة في NHP في 405nm باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية. المؤامرة هو الناتج قارئ صفيحة ميكروسكوبية من رد فعل 6 دقائق من 32 أضعاف NHP الواحد، FV التي تعاني من نقص البلازما، تجلط الدم و كلوريد الكالسيوم في صفيحة ميكروسكوبية أيضا. ويمثل المحور الرأسي التغير في الامتصاصية في 405nm التي وقعت نتيجة لتشكيل الليفين في البلازما. تم تعريف وقت تكوين الفيبرين حيث أن الوقت للوصول إلى الزيادة القصوى في 1/2 الامتصاصية أو منتصف المنحنى (36.40 ثانية). تم تعريف معدل الأولي لتشكيل الجلطة، حيث وصل سعر تغيير الامتصاصية في 405nm على نقطة لأول مرة 5 من زيادة خطية من جزء من منحنى الامتصاص (611.88 mUnits / دقيقة). السابقينتم تعريف خيمة تشكيل الجلطة على أنها الفرق بين الامتصاصية القصوى والدنيا في 405 نانومتر (0.35 وحدة). الشكل 2. المنحنيات القياسية من الوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة مقابل عامل النشاط العادي V في تجميع البلازما مرجع الإنسان باستخدام FV 1-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية. تم تخفيفه بشكل متسلسل NHP (0 – لأضعاف-512 في HBS) ويعاير مع FV 1-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية كما هو موضح في البروتوكول. وترد سجل دخول المؤامرات-من الوقت ومعدل الأولي لتشكيل جلطة مقابل النشاط FV FV في مرحلة الفحص 1-صفيحة ميكروسكوبية بعد النمذجة الانحدار الخطي للبيانات في لوحات A و B على التوالي. عينة 1-مرحلة نشاط الفحص (وحدة / مل) 1-مرحلة الفحص مدى (وحدات) <tد> 1-مرحلة الفحص الأولي قيم (mUnits / دقيقة) 2-مرحلة نشاط الفحص (وحدة / مل) 2-مرحلة الفحص مدى (وحدات) 2-مرحلة الفحص الأولي قيم (mUnits / دقيقة) حجم النشاط (وحدة / مل) NHP 1.02 0،363 744.96 7.93 0،433 375.84 6.91 مريض 1 0.36 0،404 583.80 3.84 0،432 249.96 3.48 المريض 2 0.67 0،416 704.04 5.28 0،469 323.16 4.61 <strong> المريض 3 0.31 0،435 562.08 3.92 0،453 294.96 3.61 مريض 4 0.39 0،435 617.04 4.14 0،462 372.60 3.75 5 المريض 0.73 0،401 641.40 5.91 0،433 354.24 5.18 المريض 6 0.45 0،403 600.72 4.16 0،445 393.96 3.71 7 المريض 0.49 0،395 575.40 4.89 0،449 357.48 4.40 المريض 8 0.19 0،448 489.00 2.89 0،450 330.48 2.70 المريض 9 0.64 0،423 699.48 5.11 0،455 417.24 4.47 تم تحديد الجدول 1 في نشاط FV NHP والمرضى في 9 التي وضعت المنتشر داخل الأوعية الدموية التخثر (DIC). وFV 1-المرحلة، المرحلة 2، ومجموع النشاط في NHP و 9 البلازما المريض من مدينة دبي للإنترنت 1-FV المرحلة صفيحة ميكروسكوبية معيار فحص يتم إعطاء منحنى وقت تكوين جلطة مقابل النشاط FV (الشكل 2A) وحدة / مل. معدلات الأولي (معدل الأولية للزيادة في A405nm على أول نقطة في غضون خمس mUnits / دقيقة) وبدرجات (الحد الأقصى A405nm – A40 الحد الأدنىوتبين ايضا و2-مرحلة الفحص صفيحة ميكروسكوبية – 5nm) من تشكيل جلطة في FV 1.

Discussion

الفحص الحركي طريقة صفيحة ميكروسكوبية الخطوط العريضة لتطوير الرواية، تقنية سريعة وغير مكلفة، وسهلة لقياس النشاط تخثر FV في عينات من البلازما البشرية التي لم (1-FV مرحلة الفحص) أو تم تفعيلها عمدا مع الثرومبين المضافة (FV 2 المرحلة، مقايسة). الفحص يستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية الحركية وجميع المواد والكواشف المطلوبة متوفرة تجاريا أو قد تكون في المنزل. الفحص مستمر برصد التغير في ضوء مبعثر البلازما خلال تشكيل جلطة الليفين في 405nm. الفحص صفيحة ميكروسكوبية لديه ميزة استخدام كميات صغيرة عينة البلازما (ميكرولتر)، وهي قابلة للتحليل عينات متعددة في نفس الوقت (حتى 12). هذه الصفات هي مفيدة الفحص عند استخدام معدات غالية الثمن والكواشف (تحليل الآلي والبلازما التي تعاني من نقص عامل)؛ أحجام عينة صغيرة فقط هي المتاحة (البلازما المريض) أو تحليل عدد كبير من العينات (خلال تنقية و FVROM البلازما).

الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV والمزايا أضاف أنه لأمر مريح، سريع، و لا يتطلب عزلة وتنقية المكونات التأسيسية المطلوبة. مقارنة مع دليل أنبوب الخيمة 3 و 4 و 5-7 المقايسات FV الآلي التي تم الإبلاغ عنها، وفحص صفيحة ميكروسكوبية FV لديه مجموعة مماثلة من المفيد مرات تجلط (25-75 ثانية) وما يقابلها من مستويات FV في العينة (0،5-0،005 وحدات / مل)، والحساسية / كشف حدود (20 80pM). مقارنة مع دليل المقايسات FV الخيمة أنبوب التي تعاني من تقييم مرئي شخصي لتشكيل جلطة 3 و 4 و الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV يسمح القياس الموضوعي والكمي للمرة الجلطة، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين. مقارنة مع المقايسات FV الآلي التي تعاني من شرط تحليل تكلفة والكواشف 5-7 و الفحص صفيحة ميكروسكوبية الكواشف والمواد FV غير مكلفة وجميع المواد المطلوبة قد تكون purchaالحوار الاقتصادي الاستراتيجي تجاريا أو المصنوعة في المنزل. دليل الخيمة أنبوب 3 و 4 و 5-7 المقايسات FV الآلي عموما لا توفر سوى الوقت لتشكيل جلطة؛ يست المرة، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة الليفين التي تقاس بدقة جميع طيفيا مع مقايسة صفيحة ميكروسكوبية FV. وأخيرا، دليل الخيمة أنبوب 3،4 الآلي و5-7 المقايسات FV تعاني من عدم فقط قادرة على قياس النشاط في عينات البلازما FV في وقت واحد، أما عن الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV هو قابل للارتفاع الإنتاجية و 12 عينات قد تكون يعاير في وقت واحد.

تم استخدام صفيحة ميكروسكوبية الفحص لإثبات أن FV في 9 البلازما المريض DIC كان أقل نشاطا مما كانت عليه في NHP بسبب مزيج من المرات تأخر تجلط وانخفاض معدلات الأولية لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 1-FV. لم يتم تغيير معدلات الأولية لتشكيل جلطة في فحص المرحلة 2-FV في البلازما المريض من مدينة دبي للإنترنت NHP. نطاقات من تشكيل جلطة في patien DICوأيضا ر البلازما لم يتغير من NHP في المرحلة FV 1-2-والمقايسات المرحلة. انخفض FV ربما كانت المرحلة 1، 2 المرحلة، ومجموع الأنشطة بسبب الاستهلاك المتزايد FV 19 و / أو تعطيل 6 وفقا دراسات أخرى خلال التسبب في هذا الاضطراب الدم المكتسبة. نظرا لمدى تشكيل جلطة في البلازما DIC هو نفسه كما لوحظ مع NHP، وكان هذا المتغير على الأرجح نتيجة للتركيز الفيبرينوجين في البلازما FV التي تعاني من نقص ولا علاقة لها خصائص البلازما المريض.

وأشارت النتائج من فحص صفيحة ميكروسكوبية التي يمكن الحصول عليها من قياس النشاط FV في عينات من البلازما البشرية من قيم الوقت والأولي من تكوين الجلطة من الفحص 1-FV مرحلة ووقت تكوين الجلطة والنشاط الكلي من FV 2 – مرحلة الفحص. لم يكن من الممكن الحصول على القياس الكمي للنشاط FV في عينة البلازما يعتمد على مدى تشكيل جلطة في رانه FV 1 – 2-المقايسات والمرحلة الأولي أو معدل تكوين جلطة في FV 2-مرحلة الفحص. وبالنظر إلى كل ردود الفعل وصلت تقريبا بنفس الدرجة من تشكيل جلطة من 0،35 حتي 0،45 الوحدات بين الامتصاصية الأولي قبل وبعد الامتصاص القصوى تجلط الدم والكالسيوم بالإضافة إلى ذلك كلوريد، وقياس مدى تشكيل جلطة لا يوفر التقييم الكمي للنشاط في FV نظرا عينة البلازما.

سوف تجد رواية فحص صفيحة ميكروسكوبية استخدامها في البحوث والمرافق الصحية لقياس النشاط FV في عينات من البلازما البشرية والكسور خلال تنقية لها من البلازما البشرية والحيوانية. ويمكن استخدام الفحص صفيحة ميكروسكوبية لقياس الوقت، ومعدل الأولية، ومدى تشكيل جلطة؛ المعلمات لم ترصد عموما في وقت واحد في المقايسات الخيمة أنبوب دليل وتحليل التخثر الآلي. هذه المعلومات توفر أكثر من تقييم كمي كامل للمشاركة خلال الحدث FV تشكيل جلطةفي البلازما البشرية قد ذكر سابقا من 3-7. هذه المعلومات مهم بشكل خاص في كل من البحوث والمختبرات السريرية عند قياس تغيرات هامة في النشاط FV في عينات من البلازما أو مع تنقية FV أو فعفا. ويمكن أيضا الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV تستخدم لوصف وقياس المركبات التي قد تنشيط أو تعطيل FV وفعفا، وقياس النشاط FV في المرضى المعرضين لخطر الخثار الوريدي نتيجة لطفرة لايدن FV 20 و 21 و رصد نشاط FV خلال تنقية لها من البلازما.

الفحص صفيحة ميكروسكوبية FV قابل للتكيف بسهولة لقياس نشاط أي عامل التخثر في مسار، خارجي الجوهرية، أو مشتركة باستخدام عامل المناسبة التي تعاني من نقص البلازما والشروع في تشكيل لالكواشف الليفين. فإن مقايسة زيادة فهمنا للكيمياء الحيوية من خلال قياس FV أكثر من دقيقة وكاملة نشاطها في مجال البحوث والمختبرات السريرية. نهائيلاي، سوف تؤثر بشكل إيجابي على هذه المعلومات من خلال بيئات الرعاية الصحية التشخيص المبكر وتطوير علاجات أكثر فعالية للأفراد المصابين باضطرابات تخثر، مثل مدينة دبي للإنترنت.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا البحث مع صناديق التنمية المهنية والبحث العلمي بدء التشغيل من معهد جامعة اونتاريو للتكنولوجيا (UOIT) لA. الدكتور سامي جون والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة والصحة المهنية جائزة بحوث الطلاب لLevit إيرينا. الكتاب يعترف شانون ايفرت (التدريس والتعلم المركز، UOIT) لمساعدتها إعداد الفيديو. الكتاب يعترف الدكتور مايكل E. Nesheim (قسم الكيمياء الحيوية، جامعة كوينز، كينغستون، ON) لله النصح والإرشاد، والبصيرة، والمناقشات مفيدة. الكتاب نعترف أيضا الدكتور تشنغ توه هوك (رولد دال تخثر الدم والتخثر المركز ورويال مستشفى جامعة ليفربول، ليفربول، المملكة المتحدة) لتوفير البلازما المريض DIC التي استخدمت في الدراسة.

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments (Optional)
Kinetic microplate reader Molecular Devices Spectra Max 190 SOFTmax PRO 4.3 LS software
Normal pooled human reference plasma Precision Biologicals CCN-10
Trisodium citrate Becton Dickenson B10242
EDTA Becton Dickenson B10093
FV-deficient human plasma4 Made from fresh human plasma and stored in aliquots at -70 °C.
3 and 60 ml syringes Becton Dickenson 309585 and 136898
Butterfly apparatus Vacutainer 367251 20 gauge
HEPES Sigma/Aldrich H-3375
NaCl Fisher BP358-212
Thromboplastin Trinity Biotech T1106 Dialyzed vs. HBS, pH 7.4 and stored in aliquots at -70 °C.
Calcium chloride Becton Dickenson B10070
Human thrombin15 From human plasma; stored at -20 °C in 50% (v/v) glycerol.
Dialysis membrane Fisher 21-152-6 6-8kDa molecular weight cutoff; 50mm x 3m.
Template holder and removable 8 well strips. Nunc 14-245-63 and 469957
ELISA washing trays BioRad 224-4872
1.5 ml microfuge and 15 ml screw capped tubes. Sarstedt 72690 and 62554205
Multichannel pipette Fisher 2703630 8 channel model.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Orfeo, T., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Xu, H., Butenas, S., Mann, K. G. The factor V activation paradox. J. Biol. Chem. 279, 19580-19591 (2004).
  2. Bukys, M. A., Blum, M. A., Kim, P. Y., Brufatto, N., Nesheim, M. E., Kalafatis, M. Incorporation of factor Va into prothrombinase is required for coordinated cleavage of prothrombin by factor Xa. J. Biol. Chem. 280, 27393-273401 (2005).
  3. Nesheim, M. E., Katzmann, J. A., Tracy, P. B., Mann, K. G. Factor V. Methods. Enzymol. 80, 249-274 (1981).
  4. Bloom, J. W., Nesheim, M. E., Mann, K. G. A rapid technique for the preparation of factor V deficient plasma. Thromb. Res. 15, 595-599 (1979).
  5. Samis, J. A., Stewart, K. A., Nesheim, M. E., Taylor, F. B. Factor V cleavage and inactivation are temporally associated with elevated elastase during experimental sepsis. J. Thromb. Haemost. 5, 2559-2561 (2007).
  6. Samis, J. A., Stewart, K. A., Toh, C. H., Day, A., Downey, C., Nesheim, M. E. Temporal changes in factors associated with neutrophil elastase and coagulation in intensive care patients with a biphasic waveform and disseminated intravascular coagulation. J. Thromb. Haemost. 2, 1535-1544 (2004).
  7. Cutler, J. A., Patel, R., Rangarajan, S., Tait, R. C., Mitchell, M. J. Molecular characterization of 11 novel mutations in patients with heterozygous and homozygous FV deficiency. Haemophilia. 16, 937-942 (2010).
  8. Ihara, M., Suzuki, T., Kobayashi, N., Goto, J., Ueda, H. Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol. Anal. Chem. 81, 8298-8304 (2009).
  9. Janke, R., Genzel, Y., Wahl, A., Reichl, U. Measurement of key metabolic enzyme activities in mammalian cells using rapid and sensitive microplate-based assays. Biotechnol. Bioeng. 107, 566-581 (2010).
  10. Beebe, D. P., Aronson, D. L. An automated fibrinolytic assay performed in microtiter plates. Thromb. Res. 47, 123-128 (1987).
  11. Frantantoni, J. C., Poindexter, B. J. Measuring platelet aggregation with microplate reader. A new technical approach to platelet aggregation studies. Am. J. Clin. Pathol. 94, 613-617 (1990).
  12. Pratt, C. W., Monroe, D. M. Microplate coagulation assays. Biotechniques. 13, 430-433 (1992).
  13. Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Development of a microplate coagulation assay for Factor V in human plasma. Thromb. J. 9, 11-16 (2011).
  14. Toh, C. H., Downey, C. Back to the future: Testing in disseminated intravascular coagulation. Blood Coagul. Fibrinolysis. 16, 535-542 (2005).
  15. Spero, J. A., Lewis, J. H., Hasiba, U. Disseminated intravascular coagulation: Findings in 346 patients. Thromb. Haemost. 43, 28-33 (1980).
  16. Tracy, P. B., Eide, L. L., Bowie, E. J., Mann, K. G. Radioimmunoassay of factor V in human plasma and platelets. Blood. 60, 59-63 (1982).
  17. Krishnaswamy, S., Nesheim, M. E., Pryzdial, E. L. G., Mann, K. G. Assembly of prothrombinase complex. Meths. Enzymol. 222 (Part A), 261-280 (1993).
  18. Bajzar, L., Manuel, R., Nesheim, M. E. Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 270, 14477-14784 (1995).
  19. Mammen, E. F. Disseminated intravascular coagulation (DIC). Clin. Lab. Sci. 13, 239-2345 (2000).
  20. Dahlbäck, B., Carlsson, M., Svensson, P. J. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. PNAS. 90, 1004-108 (1993).
  21. Dahlbäck, B. Advances in understanding pathogenic mechanisms of thrombophilic disorders. Blood. 112, 19-27 (2008).

Tags

Factor V ActivityHuman PlasmaMicroplate Coagulation AssayBlood CoagulationThrombinFibrinogenClot FormationProthrombinaseFV AssaysAutomated FV AssaysMicroplate PlatformEnzyme-catalyzed EventsClot LysisPlatelet AggregationCoagulation FactorsFV Activity MeasurementKinetic Microplate ReaderAbsorbance Change At 405nm

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Tilley, D., Levit, I., Samis, J. A. Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay. J. Vis. Exp. (67), e3822, doi:10.3791/3822 (2012).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image