DNA Aile karıştırma ile Mühendislik ve Sentetik adeno-ilişkili virüs Evrimi (AAV) Gen Terapisi Vektörler
Summary
Biz, moleküler DNA aile karıştırma yoluyla sentetik Adeno ilişkili viral (AAV) gen tedavisi vektörleri mühendisi ve gelişmeye temel tekniği göstermek. Ayrıca, biz seçimi ve kültür veya farelerde hedef hücreler üzerinde gelişmiş özellikleri ile bireysel kimerik capsids analizi için genel kurallar ve temsili örnekler sunuyor.
Abstract
Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörler nedeniyle yararlı özellikleri 1 benzersiz bir kombinasyonu terapötik insan gen transferi için en güçlü ve gelecek vaat eden bazı araçlar temsil eder. Bu altta yatan wild tip virüsler ve yüksek titresi, yüksek saflıkta ve klinik dereceli rekombinant vektörler 2 üretimi için son derece gelişmiş metodolojileri apathogenicity içerir. Diğer virüsler üzerinde AAV sisteminin bir diğer özel avantajı doğal olarak tüm kolayca ortak bir protokol 1,2 kullanarak vektör olarak tasarlanmış olabilir ama temel özellikleri bakımından farklıdır serotipleri ortaya çıkan bir zenginlik mevcudiyetidir. Ayrıca, kendi de dahil olmak üzere gruba bir dizi son zamanlarda da birden fazla giriş serotiplerin varlıkları, ya da izole bir tek özelliklerini geliştirmek birleştirmek sentetik vektörlerin oluşturulması için şablon olarak bu doğal virüsler kullanma stratejileri geliştirdiler. Ilgili teknolojileri bu hedeflere ulaşmak için are ya DNA aile karılma 3, kısmi benzerliklerin (tipik olarak en AAV serotip için>% 80) veya 4,5 peptid ekran, genellikle yedi amino asitlerin yani ekleme içine dayanarak yeniden montaj ile değişik AAV kapsid genlerin yani parçalanma istenen bir hücre türüne peptid ideal aracılık yeniden hedefleyen viral kapsid bir maruz döngü. Maksimum başarı için her iki yöntem protokolleri yaklaşık bir milyon farklı kapsid varyantların kütüphaneler verim kadar boyutlandırıldıktan sayede Yüksek verimli bir şekilde uygulanır. Her klon, daha sonra birçok ebeveyn virüs benzersiz bir kombinasyonu (DNA karılma yaklaşım) oluşan veya aynı viral omurga (peptid ekran yaklaşım) kendine has bir peptid içerir. Sonraki son adım en veya seçim sürecinin ideal tüm gereklerini yerine getirerek bireysel capsids için zenginleştirmek için hedef hücreler üzerindeki böyle bir kütüphane seçimi iteratif olduğunu. Tercihen tarak ikincisiBöyle anti-AAV antikorları ile reaksiyona tüm capsids örneği ortadan kaldırılması için negatif seçimi ile ilgi belirli bir hücre tipi, üzerinde büyüme gibi ines pozitif basınç,. Bu kombinasyon seçimi kalan sentetik capsids muhtemelen herhangi bir doğal AAV izole bulunan olmazdı şekilde verilen uygulama ihtiyaçlarını eşleşen şansını artırır. Burada, teorik ve iki teknolojinin deneysel daha zorlu olarak DNA aile karıştırma yöntemi odaklanın. Biz açıklamak ve göstermek karıştırılır AAV kütüphanelerinin oluşturulması ve seçim (Şekil 1) için gerekli tüm adımları ve sonra bir ihtiyacı moleküler AAV evrimi ile başarılı olmak için farkında olmak bu protokollerin tuzaklar ve eleştirel yönlerini tartışmak.
Protocol
Discussion
Burada, DNA aile karıştırma yoluyla ve hücrelerin ya da hayvanlarda evrim için gerekli deneysel adımlar ve AAV kapsid mühendisliği için yönergeleri hazırladık var. Özünde, bu protokoller biz ilk 3, 2008 yılında AAV alanı içinde bildirilen prosedürler standart versiyonları vardır. Başkaları tarafından çalışmaları takip bir telaş birçok değişiklik, örneğin, 10-13 bildirdin iken, bugünkü versiyonları yukarı ölçeklendirme ve herhangi ihtiyaçlarına uyum…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle Heidelberg Üniversitesi Mükemmeliyet CellNetworks arasında Küme tarafından yanı sıra Chica ve Heinz Schaller (CHS) vakıf tarafından olağanüstü kendi laboratuvar desteği, ekip üyeleri ve iş kabul ediyorsunuz. DNA aile karıştırma, üç yıl önce bizim ilk yayınlandığından beri çok aktif bir alan haline gelmiştir ve bu nedenle çalışma nedeniyle mekan kısıtlamaları için buraya iktibas edilemedi ilgili yayınların tüm yazarlara özür etti yoluyla Biz moleküler AAV evrim teşekkür ederiz.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 |
| Restriction enzymes | NEB | Various |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202T |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes (NEB) | F-540S |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 |
| DMSO | Finnzymes (NEB) | F-540S (part of kit) |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) |
| Tris | Roth | 4855.2 |
| Ampicilin sodium salt | Roth | K029.2 |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-shield | 1114739 |
| Phenolred | Merck | 107241 |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L90K |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman-Coulter | 342414 |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect |
| Heating block | BIOER | MB-102 |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX81 |
| FACS analyser | Beckman-Coulter | Cytomics FC500 MLP |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 |
| Benzonase | Merck | 101695 |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene | 212207 |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC |
IDTDNA | Custom primer |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC |
IDTDNA | Custom primer |
Referencias
- Grimm, D., Kay, M. A. From virus evolution to vector revolution: use of naturally occurring serotypes of adeno-associated virus (AAV) as novel vectors for human gene therapy. Curr. Gene Ther. 3, 281-304 (2003).
- Grimm, D. Production methods for gene transfer vectors based on adeno-associated virus serotypes. Methods. 28, 146-157 (2002).
- Grimm, D. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 82, 5887-5911 (2008).
- Muller, O. J. Random peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select for targeted gene therapy vectors. Nat. Biotechnol. 21, 1040-1046 (2003).
- Perabo, L. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol. Ther. 8, 151-157 (2003).
- Zolotukhin, S., Potter, M., Hauswirth, W. W., Guy, J., Muzyczka, N. A “humanized” green fluorescent protein cDNA adapted for high-level expression in mammalian cells. J. Virol. 70, 4646-4654 (1996).
- Wobus, C. E. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J. Virol. 74, 9281-9293 (2000).
- Grimm, D. Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature. 441, 537-541 (2006).
- Nakai, H. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J. Virol. 79, 214-224 (2005).
- Koerber, J. T., Jang, J. H., Schaffer, D. V. DNA shuffling of adeno-associated virus yields functionally diverse viral progeny. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008).
- Li, W. Engineering and selection of shuffled AAV genomes: a new strategy for producing targeted biological nanoparticles. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008).
- Ward, P., Walsh, C. E. Chimeric AAV Cap sequences alter gene transduction. Virology. 386, 237-248 (2009).
- Yang, L. A myocardium tropic adeno-associated virus (AAV) evolved by DNA shuffling and in vivo selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3946-3951 (2009).
- Perabo, L. Combinatorial engineering of a gene therapy vector: directed evolution of adeno-associated virus. J. Gene. Med. 8, 155-162 (2006).
- Maheshri, N., Koerber, J. T., Kaspar, B. K., Schaffer, D. V. Directed evolution of adeno-associated virus yields enhanced gene delivery vectors. Nat. Biotechnol. 24, 198-204 (2006).
- Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 14, 316-327 (2006).
- Kwon, I., Schaffer, D. V. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer. Pharm. Res. 25, 489-499 (2008).
- Perabo, L., Huber, A., Marsch, S., Hallek, M., Buning, H. Artificial evolution with adeno-associated viral libraries. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 11, 118-126 (2008).
- McCarty, D. M., Monahan, P. E., Samulski, R. J. Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis. Gene Ther. 8, 1248-1254 (2001).
