Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón
Summary
Se presenta un método para formar una ventana de imagen en el cráneo del ratón que se extiende milímetros y es estable durante meses sin inflamación del cerebro. Este método es muy adecuado para estudios longitudinales de flujo de sangre, la dinámica celular, y células / estructura vascular utilizando microscopía de dos fotones.
Abstract
En vivo de imágenes de la función cortical requiere acceso óptico hasta el cerebro, sin alteración del medio ambiente intracraneal. Se presenta un método para formar un cráneo pulido y reforzado con adelgazado (puertos) ventana en el cráneo del ratón que se extiende por varios milímetros de diámetro y se mantiene estable desde hace meses. El cráneo está adelgazada para 10 a 15 micras de espesor con un taladro de mano para lograr la claridad óptica, y después se cubrió con pegamento de cianoacrilato y una cubierta de vidrio para: 1) proporcionar rigidez, 2) inhibir la regeneración ósea y 3) reducir la dispersión de luz a partir de las irregularidades sobre la superficie del hueso. Dado que el cráneo no se rompe, la inflamación que puede afectar al proceso objeto de estudio se reduce considerablemente. Profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie cortical se puede lograr utilizando dos fotones de microscopía de barrido láser. Esta ventana se adapta bien para estudiar el flujo sanguíneo cerebral y la función celular en forma de preparados tanto anestesiados y despierto. Además, ofrece la optunidad para manipular la actividad de células utilizando optogenética o para interrumpir el flujo de sangre en los vasos dirigidos por irradiación de circulante fotosensibilizadores.
Protocol
Discussion
De dos fotones de imágenes a través de una ventana de los puertos exige la transmisión a través del hueso adelgazado y la duramadre, que atenúa la luz del láser, y añade las aberraciones ópticas a mayores profundidades 8. Sin embargo, a pesar de este inconveniente, las profundidades de imagen de hasta 250 micras por debajo de la superficie pial se puede lograr con 900 nm de excitación. Mayores profundidades de imagen puede ser en principio posible con longitudes de onda de excitación más largos <su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (beca posdoctoral de AYS) y los Institutos Nacionales de Salud (MH085499, EB003832 y OD006831 a DK). Damos las gracias a Bet Friedman y Blinder Pablo de comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Agent | Route of delivery | Dose for mouse | Duration | Notes | Source | Ref Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 μg/g | 15-60 min | Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) | IP | 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe) |
20-30 min | Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. | (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein | 7 |
| Isoflurane (Isothesia) | Inhalation | 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance | 4-6 h. | Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. | 029403; Butler Schein | 26 |
Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.
| ITEM | COMPANY | CATALOG # / MODEL |
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphine (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight | Sigma | FD2000S |
| Isopropyl alcohol | Fisher | AC42383-0010 |
| Lactated Ringer’s Solution | Butler Schein | 009846; |
| Lidocaine solution, 2 % (v/v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Surgical Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| DISPOSABLES | ||
| Carbide burrs, 1/2 mm tip size | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Cover Glass, no. 0 thickness | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Cyanoacrylate glue | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas duster | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip cement powder | Dentsply | 675571 |
| Grip cement solvent | Dentsply | 675572 |
| Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle | Butler Schein | 018384 |
| Nut and bolt to secure the head | Digikey | Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND |
| Opthalmic ointment | Butler Schein | 039886 |
| Scalpel blades | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Screws, self-tapping #000 | J.I. Morris Company | FF000CE125 |
| Silicone aquarium sealant | Perfecto Manufacturing | 31001 |
| Tin oxide powder | Mama’s Minerals | EQT-TINOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glass scribe | Fisher Scientific | 08-675 |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Electric powered drill | Foredom or Osada | K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada) |
| Electrical razor | Wahl | Series 8900 |
| Forceps, Dumont no. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Feedback regulated heat pad | FHC | 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07) |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulse oximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Screwdriver, miniature | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars) |
| Surgical scissors, blunt end | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultrasonic cleaner | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.
Referencias
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