Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징
Summary
우리는 (ImageStream 기술의 사용을 설명<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> www.amnis.com</a>), 당신이 잘 정의된 환자의 동료에서 일차 면역 세포의 세포 메커니즘을 계량하기 위해, 동시 고해상도 디지털 영상과 함께 양적 유동세포계측법을 자랑합니다. 우리의 연구 주제 무리에서 소형 시료의 혈통 특정 세포 반응을 계량하기위한 translational 수사 청사진을 제공합니다.
Abstract
면역 상태에서 개별 유사 감염에 반응을 파악하고 질병의 심각도 및 결과에 기여. 고령화는 바이러스성 및 세균성 감염으로 증가 자화율와 연관된와 체액에 잘 문서화된 감소뿐만 아니라 세포 매개 면역 반응의 1,2와 백신에 반응을 감소합니다. 우리는 최근에 수신자와 같은 수용체 (TLRs), 미생물 감염 및 트리거 항균 호스트 방어 반응 3 감지 타고난 면역 시스템의 주요 구성 요소에 노화의 영향을 평가했습니다. 건강한 인간 기증자의 큰 일대에서, 우리는 노인에서 해당 말초 혈액 monocytes 표현 및 특정 TLRs 4와 돌기 세포에서 유사한 감소 TLR 수준 및 신호 응답 (DC가)의 기능을 감소 보여줬에 필수적입니다 세포를 항원 제시 타고난 및 적응 면역 5 사이의 결합. 우리는 macrophages에 TLR3의 dysregulation을 보였습니다웨스트 나일 바이러스 6,7와 감염에 대한 반응으로 노인 기증자로부터 DC가에 의한 IFN의 D 낮은 생산.
immunosenescence 우리의 이해와 치료 개입 파라마운트 응답 특정 세포 유형에 대한 자세한 이해와 신호 전달의 메커니즘 (들)입니다. FACS 또는 immunoblot에 의해 일차 전지 및 측량 세포 마커 영상을 통해 면역 반응의 전통적인 연구 결과 그러나 이러한 연구는 일반적으로 환자에서 제공하는 작은 샘플 볼륨과 여러에 복잡한 실험실 기술을 수행하는 무능력에 의해 기술적으로 제한되며, 크게 우리의 이해를 전진했습니다 인간의 샘플. ImageStream 동시 고해상도 디지털 영상과 양적 유동세포계측법을 결합하기 때문에 환자 자화율의 효율적인 캡처를위한 contemporaneously 여러 세포 인구의 조사를 용이하게합니다. 여기에서 DC가 ImageStream의 사용을 평가하기 위해 입증 TLR7 / 8인산화 및 면역 반응 8에 대한 중요한 여러 유전자의 전사를 시작하는 주요 전사 인자, NF-κB의 핵 translocation의 활성화 – 중재 증가합니다. 우리는 또한 최근 TLR5 신호와 9 노화에 변경된 면역 반응에 기여할 수 오래된 기증자로부터 monocytes에서 NF-κB 경로의 이전에 인식되지 않는 변경을 보여,이 기술을 사용했습니다.
Protocol
Discussion
translational 연구를위한 ImageStream의 사용에서 중요한 단계는 관련 비교 그룹 및 최적화 및 항체 특이성의 검증의 선택입니다. 분류 대상에서 대상 그룹 간의 차이점 histograms 및 세포 영상을 통해 예가 될 것입니다. 관련 수용체 및 신호 전달 경로의 변화에 대한 철저한 분석과 결합된 이러한 데이터는 전문적인 동료에 면역 dysregulation을 기초 메커니즘에 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다. 기술?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089,992, 그리고 NCRR / GCRC 프로그램 M01-RR00125)에 의해 부분적으로 지원되었다. 저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않고 박사 마크 Shlomchik, 예일 세포 분류기 핵심 시설의 이사 감사합니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Referencias
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
