定量成像小样本人体血液中单核细胞和树突状细胞系特定的Toll样受体介导的信号
Summary
我们描述ImageStream技术的使用（<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> www.amnis.com</a>），它结合了定量流式细胞仪同时高分辨率数字成像，量化定义良好的病人同伙的主要免疫细胞的细胞机制。我们的研究提供了一个蓝图转化调查量化谱系在小样本的具体细胞的反应，受同伙。
Abstract
在免疫状况的个体差异决定的反应，感染和疾病的严重程度和结果作出贡献。老龄化与病毒和细菌感染的易感性增加和减少记录在体液下降以及细胞介导的免疫反应1,2疫苗的反应。我们最近评估Toll样受体（TLRs），检测微生物感染和触发抗菌宿主防御反应3的先天免疫系统的关键部件老化的影响。在一个健康的器官捐献者的大型队列中，我们发现，从老人的外周血单核细胞减少某些Toll样受体4和减少类似的TLR水平和树突状细胞信号反应（DCS）的表达和功能，抗原提呈细胞，关键在5先天免疫和适应性免疫之间的联系。我们已经表明巨噬细胞中TLR3的失调低层D老人捐助者的区议会感染西尼罗河病毒6,7干扰素生产。
我们的免疫衰老的理解和干预治疗的最重要的是一种特定的细胞响应类型的详细了解和信号转导机制（S）。主要通过流式细胞仪或免疫细胞和测量细胞标记成像，通过传统的免疫反应的研究进展显着，我们的理解然而，这些研究一般限于小样本量可从患者和无法进行多个复杂的实验室技术，技术上人体标本。 ImageStream同时高分辨率数字成像结合定量流式细胞仪，从而促进病人易感性的高效捕获contemporaneously调查在多个细胞群。在这里，我们展示的ImageStream在区议会的使用，以评估TLR7 / 8磷酸化和核易位的一个关键转录因子NF-κB，从而启动众多8免疫反应的关键基因的转录激活介导的增加。使用这种技术，我们最近也证明先前未确认变更的TLR5的信令和捐助者从旧的单核细胞NF-κB信号通路，可能有助于改变老化9免疫反应。
Protocol
Discussion
ImageStream用于翻译研究的关键步骤是选择相关的对照组和特异性抗体的优化和验证。主题标记的目标群体之间的差异是显而易见的，通过直方图和细胞图像。结合深入分析了有关的受体和信号通路的变化，这些数据将提供宝贵的见解机制的基础免疫失调，在专门的同伙。该技术将受到足够的亲和力有关目标的特异性抗体的可用性。此外，该仪器是最适合多用户设施和分析软件，需要掌握一些护理?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的一部分，由美国国立卫生研究院（N01，HHSN272201100019C，19岁以下人工智能089992，NCRR / GCRC计划M01-RR00125的）。作者声明没有竞争的金融利益，并感谢的马克Shlomchik博士，耶鲁大学的细胞分选仪的核心设施。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Referencias
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