Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

1. Криоконсервация спермы мыши Для каждой линии, которая будет криоконсервированных, подготовить следующие перед началом. 1 скважина 4-а блюдо с 240 л комплекта CPA 15 криоконсервации спермы соломинки следующим Подключите 0,25 мл соломинки для 1 мл шприцы с ватный тампон ближе всего к шприц. В каждом из соломы, нагрузка 8 см (примерно 160 мкл) среднего ЭКО, то 1 см воздуха. Этикетка соломинки с названием линии должны быть сохранены. LN 2 должна быть 15 см глубиной в пене окно. Закрыть крышкой. Эвтаназии 2 самцов мышей из каждой строки будет криоконсервированных. Мыши должны быть от 10 до 60 недель. Удалите два хвостовых epididymides вместе с семявыносящих протоков от каждой мыши. Место epididymides в ранее подготовленный CPA содержащих также из 4-а блюдо (шаг 1.1). Сделайте 5-7 продольные разрезы в каждой придатка яичка и мягкосжать каждый семявыносящих протоков подтолкнуть сперму из. Встряхните CPA и придатка смесь вручную осторожно при комнатной температуре в течение 3-5 минут. Это позволит спермы выплыть. Использование заранее подготовленный соломы, аспирации 5 мм (примерно 10 мкл) спермы подвески и 1 см воздуха. Повторите эту процедуру до в общей сложности 15 соломинку. Загрузка и печать соломинки в течение 10 минут для лучшей спермы выживания. Тепло печать с обеих сторон соломы тщательно. Место соломинки в морозильной канистры со спермой колонки в первую очередь. Прикрепить 1 мл пипетки предоставляются как часть комплекта для канистру расширить ручкой. Место канистру в LN 2 в пене ящик через отверстие в крышке. Разрешить канистру плавать вертикально в LN 2 в течение 10 минут. Погрузитесь в канистру LN2. Сперма теперь криоконсервированных и могут быть перемещены в долгосрочной LN 2 хранения. Контейнер не должен использоваться дляСледующая строка, пока она разогревается до комнатной температуры. 2. Мышь суперовуляции Как правило, используют молодых самок мышей той же фоне, как доноров спермы. Мыши должны быть ~ 12 г (3-4 недель). Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ Беременные кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG). Подождите 46-48 часа. Выполните внутрибрюшинного введения с 5-10 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). Урожай ооцитов 14-16 часов после инъекции ХГЧ, как описано ниже. 3. Мышь восстановления спермы и ЭКО Перед ЭКО, для каждого соломы можно размораживать, готовить следующий и равновесие, по крайней мере один час в 37 ° C CO 2 инкубатора. Сперма инкубации блюдо: одна 35 мм чашки Петри, с 90 мкл капли спермы лечения среды (СТМ) покрыты маслом. Резка блюдо: Для ооцитов коллекцию из более 10 секuperovulated самок, одна 35 мм чашки Петри с 3 мл среды ЭКО. ЭКО хорошо: Для каждой группы из 5 superovulated женщин для проведения ЭКО, одну лунку 4 также блюдо с 500 мкл среды ЭКО (если вы используете 10 superovulated женщин, например, вам потребуется 2 скважины…) Стиральная блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 3 мл калия простого оптимизированный среды (KSOM) для промывки каждую лунку 4-хорошо ЭКО блюдо использоваться Культура блюдо: одна 35 мм чашки Петри с 50 мкл капли KSOM среды покрыты маслом для культивирования эмбрионов из каждой лунки этого блюда ЭКО. Удалить из соломы LN 2 и место в 37 ° С на водяной бане 2-3 минут. Удалить соломы с водяной бани и протереть, чтобы удалить лишнюю воду. Сделайте первый срезаны близко к первой колонке воздуха ближайшее ватный тампон. Вырезать соломы в среднесрочной ЭКО еще будет столб воздуха обнаружены до начала спермы колонке. Затем вырежьте конце соломы сecond столб воздуха, соблюдая осторожность, чтобы избежать сокращения спермы колонке. Вырезать под углом 45 – это будет сделать намного легче для аспирации спермы. Аспирацию спермы отстранение от дистального конца соломы с 200 мкл пипетки. Место спермы суспензии в центре STM падение и инкубировать блюдо в течение 45-60 минут при 37 ° C 5% СО 2 инкубатора. Во время инкубации спермы, рассекать яйцеводов из superovulated женщин в резки блюдо. Используйте иглу 30 г или щипцами рвать каждый яйцевод, выпустив кучево-ооцитов комплексов (КОК). Избегайте жира и крови в среде ЭКО как грязным средств массовой информации делает дополнительные шаги для стирки. После того как все яйцеводы были оторваны, передача КОК из 5 сук каждому ЭКО скважин. Число КОК производства суперовуляции очень штамм зависимыми. Сбор 10-15 мкл спермы от периферии STM падение и удобрять один ЭКО также около 14-16 часов после ХГЧ Injперегиба. Повторите оплодотворения для каждой скважины используются. Конечная концентрация сперматозоидов будет примерно 1 млн / мл. Спермы и ооцитов Coculture в течение 4-6 часов при 37 ° C 5% СО 2 инкубатора. Промыть эмбрионы с KSOM минимум в 2 раза и культуры в каплях KSOM для развития в 37 ° C 5% СО 2 инкубатора. ЭКО ставка была рассчитана как два клеточной стадии эмбрионов из общего ооциты использовать после ночной культуры. 4. Представитель Результаты Сперма от 5 Charles River мыши инбредных линий были заморожены. Защита коэффициенты рассчитываются путем деления величины оценки замороженных сперматозоидов свежим значений оценки спермы. Защита отношения подвижность сперматозоидов была 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5%, 61,0% для C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно. Защита отношения для быстрого прогрессивная подвижность была 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8%, 54,1% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 1). ЭКО ставки с замороженной спермы талой были 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% и 26,2% в C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl и BALB / cAnNCrl, соответственно (рис. 2) . За 1,5 лет, 49 линий ГМ-мыши были заархивированы спермой криоконсервации. Эти строки были позже успешно восстановлен (как определено в живых щенков родившихся) по ЭКО в 4-х женских штаммов (C57BL / 6, BALB / с, DBA / 1 и 129Sv) (рис. 3). Рисунок 1. Защита коэффициенты подвижности сперматозоидов и быстрая прогрессивная подвижность у мышей Рисунок 2. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей 3713fig3.jpg "/> Рисунок 3. Экстракорпоральное оплодотворение с Frozen-талого спермы у мышей GM