전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

1. 마우스 정자 cryopreservation cryopreserved하는 각 라인에 대한, 시작하기 전에 다음 사항을 준비합니다. 키트 CPA의 2백40리터과 4 잘 요리 잘 하나 다음과 같이 15 정자 cryopreservation의 빨대 주사기에 가장 가까운 면화 플러그 하나 ML 주사기로 0.25 ML 빨대를 연결합니다. 각 짚으로 다음 IVF 매체의 8cm (약 160 μl), 공기의 1cm를로드합니다. 보존하는 라인의 이름으로 빨대를 분류. 아까 2 폼 상자에 깊이 15cm해야합니다. 뚜껑을 닫습니다. cryopreserved 수 각 라인에서 2 수컷 쥐를 안락사. 마우스는 10 및 60 주 된 사이 여야합니다. 각 마우스의 중이야 deferens과 함께 두 개의 꼬리 epididymides를 제​​거합니다. 이전에 준비한 4 잘 요리 (단계 1.1)의 잘 CPA 함유로 epididymides를 놓습니다. 5-7 세로 각 epididymis의 상처와 부드럽게 만들기정자를 밀어 각 중이야의 deferens를 당겨요. 3~5분에 대한 실온에서 부드럽게 손으로 CPA와 epididymis 혼합물을 흔들어. 이것은 정자가 수영을하실 수 있습니다. 이전에 준비 빨대를 사용하여 정자 서스펜션의 5mm를 (약 10 μl) 대기음 그리고 공기의 1cm. 15 빨대 총까지이 과정을 반복합니다. 로드와 최고의 정자 생존을위한 10 분 이내에 빨대를 밀봉. 조심스럽게 빨대의 양쪽을 밀봉 가열. 먼저 정자 칼럼과 냉동 용기에 빨대를 놓습니다. 손잡이를 연장 용기에 키트의 일부로 제공 제 1 ML의 피펫을 첨부합니다. 뚜껑에있는 구멍을 통해 거품 상자에 아까 2 용기를 놓으십시오. 10 분 후면 2 세로 부동에게 용기를 허용합니다. LN2에 용기를 담가. 정자는 현재 cryopreserved되고 장기 에선이 스토리지로 이동하실 수 있습니다. 용기는 사용하지 않아야다음 라인은 그 때까지 실내 온도 예열합니다. 2. 마우스 superovulation 일반적으로 정자 기증자와 같은 배경의 젊은 여성 생쥐를 사용합니다. 마우스는 ~ 12g (세 3-4주)하여야한다. 임신 암말 혈청 gonadotropin (PMSG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다. 46-48시간 기다립니다. 인간 chorionic gonadotropin (hCG)의 50-10 IU와 intraperitoneal 주사를 수행합니다. 아래에 설명된대로 hCG 주사 후 수확 oocytes가 14-16 H. 3. 마우스 정자 복구 및 IVF IVF 전에 해동하는 각 빨대에 대해, 37 ° C CO 2 배양기에서 적어도 한 시간 동안 다음을 준비하고 평형. 정자의 배양 접시 하나 35mm 페트리 접시, 기름으로 덮여 정자 치료 매체 (STM)의 90 μl 드롭과 함께. 접시를 절단 : oocyte 컬렉션 10 s의 최대의uperovulated 여성, IVF 매체 3 ML 하나의 35mm 페트리 접시. IVF 잘 : IVF 5 superovulated 여성, IVF 미디어 500 μl (… 당신은 10 superovulated 암컷을 사용하는 경우, 예를 들어, 2 우물이 필요합니다)와 함께 4 잘 요리 잘 한 각 그룹에 대한 사용하는 4 잘 IVF 요리의 각 잘 세척을위한 칼륨 단순 3 ML 최적화된 미디어 (KSOM) 하나의 35mm 페트리 접시 : 접시를 세척 문화 요리 : IVF 요리의 각 우물에서 배아 문화의 기름으로 덮여 KSOM 매체 50 μl 방울 한 35mm 페트리 접시. 후면 2 밀짚 후 2-3 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에서 장소를 제거합니다. 물 목욕에서 짚을 제거하고 여분의 물을 제거하는 닦아냅니다. 면화 플러그 가까운 최초의 공기 열에 가까운 첫 번째 절개를합니다. 여전히 정자 칼럼 전에 보이는 공기 칼럼있을 것입니다 IVF 미디어에서 짚을 잘라. 다음의에서 빨대의 끝을 잘라econd 공기 열, 정자 열을 절단되지 않도록주의하고. 45 각도로 절단 – 이것은 정자를 대기음하는 것이 훨씬 쉽게됩니다. 200 μl pipettor와 빨대의 말초 끝에서 정자 현탁액을 기음. STM 드롭의 중심에있는 정자 현탁액을 놓고 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 45~60분을위한 요리를 품어. 정자 보육 동안 절단 접시에 superovulated 여성의 oviducts을 해부하다. 적운 – oocyte의 단지 (COCs)를 발표, 각 수란관를 조각조각 30g 바늘이나 집게를 사용합니다. 더러운 미디어가 추가 세척 단계를 만들면서 IVF 미디어의 지방과 혈액을 피하십시오. 일단 모든 oviducts가 찢어진되었습니다, 5 암컷에서 각 IVF 우물에 COCs을 전송. superovulation에 의해 만들어진 COCs의 수는 매우 의존 변형입니다. STM 드롭의 주변에서 정자의 10-15 μl를 수집 한 IVF 거름을 잘 약 14-16시간은 hCG inj을 게시ection. 각 잘 사용에 대한 수정을 반복합니다. 최종 정자 농도는 약 1,000,000 / ML 것입니다. 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 4~6시간에 대한 Coculture의 정자와 oocytes. 37 ° C 5% CO 2 배양기에서 개발 KSOM의 방울에 2 회 문화 KSOM 최소 배아를 씻으십시오. IVF 속도는 밖으로 야간 문화 이후에 사용되는 총 oocytes의 두 세포 단계의 배아로 계산되었다. 4. 대표 결과 5 찰스 리버 마우스 근친 계통에서 정자가 냉동했습니다. 보호 비율은 신선한 정자 평가 가치에 의해 냉동 정자 평가 가치를 나누어 계산됩니다. 정자 운동성의 보호 비율은 각각 60.2 %, 81.3 %, 78.6 %, 66.5 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl에 대한 61.0 %, 있었다. 빠른 진보 운동성에 대한 보호 비율은 47.3 %, 69.4 %, 57.0 %, 52.8 %, C57BL/6NCrl, 129S2/SvPas에서 54.1 % 있었다 CRL, FVB / NCrl, DBA/2NCrl, 각각 BALB / cAnNCrl (그림 1). 냉동 – 해동 정자로 IVF 요금은 55.7 %, 26.4 %, 87.3 %, 87.8 % 각각 26.2 C57BL/6NCrl에서 % 129S2/SvPasCrl, FVB / NCrl, DBA/2NCrl 및 BALB / cAnNCrl, (그림 2)되었습니다 . 1.5 년 동안, 49 GM 마우스 라인 정자 cryopreservation에 의해 보관되었습니다. 이 라인은 나중에 성공적으로 네 여성의 종자에서 IVF (C57BL / 6, BALB / C, DBA / 1 129Sv) (그림 3)에서 (로 태어나 살고 새끼에 의해 정의된) 복구되었습니다. 그림 1. 마우스의 정자 운동성 및 신속한 프로 그레시브 운동성의 보호 비율 마우스에서 냉동 – 해동 정자와 함께 그림 2.에서는 시험 관내 수정 3713fig3.jpg "/> 그림 3. GM의 마우스에서 냉동 – 해동 정자와 체외 수정을의