Le test neuroblaste: Un test pour la génération et l'enrichissement des cellules souches neuronales à partir de différenciation des cellules souches neurales Progeny Par cytométrie en flux
Summary
Ce protocole vidéo démontre une nouvelle méthode pour la génération et la purification ultérieure des cellules progénitrices neuronales à partir d'une source renouvelable de cellules souches neurales (CSN) en fonction de leur physique (taille et granularité interne) et les propriétés fluorescentes en utilisant la technologie de cytométrie en flux.
Abstract
Les cellules souches neurales (CSN) peuvent être isolés et élargi à grande échelle, en utilisant le test neurosphères et différenciés dans les trois principaux types de cellules du système nerveux central (SNC); à savoir, les astrocytes, oligodendrocytes et des neurones. Ces caractéristiques font de souches neurales et les cellules progénitrices une source inestimable renouvelable de cellules pour des études in vitro, tels que le dépistage des drogues, neurotoxicologie et l'électrophysiologie et aussi pour la thérapie de remplacement cellulaire dans de nombreuses maladies neurologiques. En pratique, cependant, l'hétérogénéité de la descendance NSC, la faible production de neurones et des oligodendrocytes, les astrocytes et la prédominance de la suite de différenciation limiter leurs applications cliniques. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour la purification de production et subséquente des neurones immatures de NSC descendance murin utilisant la fluorescence tri cellulaire (FACS) de la technologie. En utilisant cette méthodologie, une population hautement enrichi de cellules souches neuronales peuvent être atteints d'espritHout toute astrocytes notable et de bonne foi la contamination NSC. La procédure comprend la différenciation des produits de filiation du NSC isolé et agrandi à partir de E14 éminences ganglionnaires de souris en utilisant le test neurosphères, suivie par l'isolement et l'enrichissement de cellules immatures neuronaux en fonction de leurs propriétés physiques (taille et la complexité interne) et fluorescente utilisant la technologie de cytométrie en flux. Dans l'ensemble, cela prend 5-7 jours pour générer neurosphères et 6-8 jours pour différencier descendance NSC et d'isoler hautement purifié des cellules neuronales immatures.
Protocol
Discussion
La capacité d'isoler des populations définies de cellules neurales (neurones à savoir, astrocytes et oligodendrocytes) pourrait résoudre certains des obstacles associés à l'application clinique des cellules souches neurales (CSN). Tout d'abord, il nous permet de caractériser complètement la population de départ de cellules du donneur. Deuxièmement, il nous permet d'utiliser un type cellulaire particulier ou une combinaison de différents types de cellules avec un rapport spécifique, en fonctio…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le financement de la Fondation Overstreet.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referencias
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
- Amariglio, N. Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient. Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).
