神经母细胞含量：从区分神经干细胞后代使用流式细胞仪，神经祖细胞的生成和富集含量
Summary
这个视频协议，表明了新方法的产生和后续的纯化，根据自己的身体（大小和内部的粒度）和荧光性能，使用流式细胞仪技术从可再生来源的神经干细胞（NSCs）的神经祖细胞。
Abstract
神经干细胞（NSCs）可以分离和扩大规模大，使用的神经球法和中枢神经系统（CNS）的三个主要类型的细胞分化，即星形胶质细胞，少突胶质细胞和神经元。这些特点使神经干细胞和祖细胞在体外研究，如药物筛选，神经毒理学和电，也为许多神经系统疾病的细胞替代疗法的一个宝贵的可再生的细胞来源。然而，在实践中，国科会的后代，低生产的神经元和少突胶质细胞和星形胶质细胞的分化限制其临床应用后优势的异质性。在这里，我们描述了一个新颖的方法，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，从国科会的后代小鼠未成熟神经元的生成和随后净化。使用这种方法，一个非常丰富的神经祖细胞的人口可达到机智豪特任何明显的星形胶质细胞和真正的国科会污染。该程序包括分化E14小鼠神经节隆起，使用的神经球检测其物理（大小和内部的复杂性）和荧光性能，使用流式细胞仪技术的基础上，由未成熟的神经细胞的分离和富集分离和扩大NSC的后代。总体而言，它需要5-7天，产生神经球和6-8天来区分国科会的后代和分离高纯度未成熟的神经细胞。
Protocol
Discussion
隔离定义的神经细胞群（即神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞）的能力可能会解决一些与临床应用神经干细胞（NSCs）的相关障碍。首先，它使我们的供体细胞的人口开始充分体现。第二，它可以让我们使用一个特定的细胞类型或不同类型的细胞组合，与特定的比例，根据疾病的性质或阶段。最后，使用高浓缩铀的预分化的神经细胞的祖细胞，可以显着降低可能不受控制地增殖和肿瘤的形…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是从斯特里特基金会的资金支持。
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | Gibco | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | Gibco | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Falcon | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| Anti-PSA-NCAM-PE | Antibody | Miltenyi Biotec | 130-093-274 | |
| PE- Conjugated mouse IgG1 | Isotype control antibody | BD Pharminogen | 556029 | |
| Heparin | Growth factor | Sigma | H4784 | Reconstituted in PBS |
| HrBMP-4 | Growth factor | R&D | 314-BP-010 | |
| Poly-L-Ornithine | Reagent | Sigma | P4957 | |
| Fetal Calf Serum | Medium Supplement | Gibco | 10099-141 | |
| GFAP | Antibody | DAKO | Z0334 | |
| B-III tubulin | Antibody | Promega | G7121 |
*To make HEM, mix 1 x 10 L packet of MEM and 160 ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4 °C.
Referencias
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457 (2011).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
- Scheffler, B. Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).
- Azari, H. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).
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