일반 잉크젯 프린터를 사용하여 과도 세포막의 세공 만들기
Summary
bioprinter로 HP 데스크젯 500 프린터를 변환하는 데 사용 방법의 설명입니다. 프린터 멤브레인에 과도 모공의 원인이 생활 세포를 처리할 수있다. 이러한 모공은 인쇄 세포에 형광 G-actin을 포함한 작은 분자를, 통합하기 위해 활용할 수 있습니다.
Abstract
Bioprinting은 조직 공학, 직접적인 세포 응용 프로그램 요법, 그리고 바이오 센서 microfabrication 포함한 애플 리케이션 및 의의 광범을 가지고 있습니다. 최근 1-10을 열 잉크젯 프린팅은 또한 유전자 transfection에 사용되고 있습니다. 8,9 열 잉크젯 프린팅 공정에 표시되었다 일시적으로 세포 생존에 영향을주지 않고 세포 세포막을 중단. 멤브레인의 과도 모공은 달리 세포 세포질에, 멤브레인을 통과하기에는 너무 큰 것입니다 분자. 8,9,11을 소개하는 데 사용할 수 있습니다
여기를 시연중인 응용 프로그램이 세포에 fluorescently 레이블 G-actin의 단량체의 설립을위한 열 잉크젯 인쇄의 사용이다. 세포로 분자를 주입하기 위해 열 잉크젯 프린팅을 사용의 장점은 기술은 세포에 비교적 양성이라는 것입니다. 인쇄 후 8, 12 세포 생존 능력은 표준 셀 괞찮아과 비슷한 것으로 표시되었습니다힘들 방법 1,8. 또한, 잉크젯 프린팅 수동 microinjection보다 훨씬 빠르다있는 분이면 세포의 수천을 처리할 수 있습니다. 인쇄에 의해 만들어 모공은 약 두 시간 종료 표시되었습니다. 그러나, 작은 단백질 및 / 또는 입자와 세포를 주입에 기술을 제한 이러한 인쇄 기술과 (~ 10 nm의)를 만들었 기공의 크기에 제한이 있습니다. 8,9,11
표준 HP 데스크젯 500 프린터가 삭제되었습니다 8 프린터의 커버, 3, 5. 세포 인쇄할 수 있도록 수정 및 용지 피드 메커니즘이 기계 레버를 사용하여 무시였습니다. 무대는 직접 프린트 헤드 아래 현미경 슬라이드 및 coverslips의 배치 수 있도록 만들었습니다. 잉크 카트리지가 개설되었습니다 잉크가 제거되었고 그들은 세포와 함께 사용하기 전에 청소했다. 인쇄 패턴 그런 다음 간단한 인쇄 명령을 통해 프린터를 제어 표준 그리기 소프트웨어를 사용하여 만들었습니다. 3T3 fibro폭발은 합류로 성장 trypsinized 후 인산으로 resuspended 것은 용해 fluorescently 레이블 G-actin의 단량체와 염분 버퍼되었다. 세포 현탁액은 잉크 카트리지로 pipetted되었고 세포 라인은 유리 현미경 커버 전표에 인쇄되었다. 살아있는 세포는 형광 현미경을 사용하여 몇 군데되었으며 actin은 세포질 전반에 걸쳐 발견되었다. 세포에 형광 actin의 설립은 짧은 시간 cytoskeletal 역학 이미징 가능하며 어플 리케이션의 광범위한 유용합니다. 13-15
Protocol
Discussion
bioprinting위한 표준 잉크젯 데스크탑 프린터를 변환하는 과정은 특별히 어렵지 않습니다. 가장 어려운 단계는 사용하는 프린터의 브랜드와 모델에 따라 달라집니다 용지 피드 메커니즘을 우회하는 방법을 결정합니다. 여기에 설명된대로 용지 공급 센서가 기계적 때 그러나 이것은 비교적 간단합니다. 광학 공급 센서가있는 모델의 경우, 다른 기술은 종이를 사용하는 생각으로 프린터를 속일 고용해야 할 수도 있습니다, 그것은 현미경 슬라이드를 인쇄하는 동안 예를 들어, 하나는 프린터를 통해 종이의 작은 조각을 실행할 수 있습니다. 용지 피드 메커니즘을 우회하는 것은 다른 프린터 모델이 절차를 적용하는 가장 어려운 단계가 될 가능성이 높습니다.
인쇄 coverslips을 잡아 무대를 구성하면 올바른 정렬과 높이를 확보하는 것이 중요합니다. 단계는 인쇄 영역의 중앙에 배치되는 coverslip 수 있도록해야합니다. 또한, PL해야적절한 높이의 에이스는 coverslip 인쇄 카트리지에 대한 허가는 그것을 중단하지 않고 슬라이드를 통해 전달할 수 있도록합니다. 무대의 정확한 높이는 프린터 모델에 따라 달라집니다.
인쇄된 전지가 씻겨되지 않도록하려면 슬라이드를 즉시 추가적인 세포 성장 매체가 추가되기 전에 세포 부착이 가능하도록하기 위해서 약 30 분 동안 인쇄 후 인큐베이터에 배치되었다. 세포는 PBS 대량의 세포가 건조하고 실용적 남아 않았을 포함하는 용액에 인쇄하고 있었 으니까. 전지 셀 (5-7 피규어 1) 내부의 태그를 G-actin의 단량체의 분포를 시각적으로 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 있었다. 3T3 섬유아 세포로 인쇄하면 그림 5는 actin이 형광하기 위해 세포의 많은 원인이 있지만, 향상된 밝기의 라인을 보여주는 함께 대표적인 결과를 보여줍니다. fluorescently cytoskeleton에 G-actin 태그의 정관은cytoskeletal 역학과 세포 역학 연구하는 데 유용합니다. 12-15이 기술의 한계는 약 10 nm의보다 작은 직경을 가지고 분자와 단백질에 대해서만 적용한다는 것입니다.
그 세포가 실제로 변환된 프린터에 의해 처리되고 있었다 보장하기 위해 DAPI는 (PBS에서 1:5000) 순수한 PBS의 볼륨의 절반 대신에 bioink에 추가되었습니다. 형광 얼룩 DAPI는 핵에있는 DNA의 아미노산 풍부한 부분에 바인딩합니다. 따라서 DAPI가 인쇄된 세포의 fluorescently 이미징 핵에 유용 얼룩이다. 그림 6은 알렉사 형석 488 (actin)과 모두의 오버레이 이미지와 DAPI (핵) 형광을 모두 표시하는 세포의 대표 이미지를 보여줍니다. 그림 7은 또한 방법을 보여줍니다 샘플로 입금되었습니다 비 생물 학적 물질 때문에 absenc의 형광되지 않습니다 동안 세포는 G-actin의 단량체가 통합되어 한 형광 빛이 나겠G-actin의 단량체의 전자.
bioprinting위한 하나의 중요한 고려 사항 bioink에 사용되는 수성 미디어입니다. 그것은 혈청과 표준 세포 성장 미디어를 사용하면 일관성없는 결과를 굴복 것으로 나타났습니다. 이것은 대부분 혈청 단백질에 의한 프린트 헤드 노즐의 막힘으로 인한 것입니다. PBS의 사용은 인쇄 패턴의 일관성을 증가하고 세포의 숫자는 입금. PBS를 사용하는 한 가지 단점은 세포가 시간의 장시간 기간 동안 정학에 남아해서는 안된다는 것입니다. 그러나 이러한 예제에있는 섬유아 세포는 세포 생존 능력에는 변화와 함께 적어도 한시간 동안 bioink 조건을 용인할 수 있었다. 이것은 열 잉크젯 메카니즘을 통해 인쇄된 전지가 높은 생존 속도를 가지고 나타난 것으로보고 몇 가지 사전 조사 결과와 일치합니다. 2-8
이 수정된 프린터 설정은 전지 인쇄가 아닌 다른 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. 등 콜라겐이나 fibrone 등 16-22 매트릭스 단백질,ctin, 쉽게 세포 patterning에 대해 유용할 수 있습니다이 기술과 기판에 인쇄할 수 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 타입의 경우 전 라인 패턴으로 성장 요인을 포함하여 매트릭스 단백질, 기타 분자 이외에 체외 세포 배양 연구 인치 17에 사용할 수있는 정렬 콜라겐 기판집니다 인쇄, 안정적으로 세포 연구를 위해 기판에 현지하실 수 있습니다 그리고 잠재적인 치료 응용 프로그램입니다. 18
위의 단계에서 설명한 디자인의 주요 한계는이 프린터가 하나 이상의 차원에서 인쇄할 수 없다는 점입니다. 여기에는 비계 인쇄와 같은 패턴 응용 프로그램에 사용하기위한 잠재력을 제한합니다. 3D 인쇄를 허용하려면 전문 단계는 사용해야합니다. 무대 bioink의 계층별로 레이어 증착에 대한 증분 높이 조정이 필요 해요.
Bioprinting은 조직 공학을위한 효율적이고 비용 효과적인 방법으로 약속을 보여주었다, 유전자 transfection, micropatterning 및 microarray 제조 1-12, 16-22 장치의이 유형의 미래 애플 리케이션 등 다양한 있습니다. 공사장 공중 발판 진입 통제 및 패턴 셀룰러 microenvironments, 세포 세포질에 macromolecules의 설립, 그리고 세포의 증착의 창설 그리고 자연적으로 또는 효과적으로 발생하지 않는 구조.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 세포 인쇄 HP의 데스크젯 프린터 사용의 아이디어에 대해 박사 토마스 Boland을 인정하고 싶습니다. NSF RII – EPS 0,903,795 및 NIH K25 HL0922280에서이 프로젝트를위한 자금.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| HP DeskJet 500 | Hewlett-Packard | C2106A | Discontinued from manufacturer. Purchased refurbished DEC Trader. |
| HP 26 Black Ink Cartridge | Hewlett-Packard | 51626A | |
| Actin from rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate, 200 μg | Invitrogen | A12373 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | MP Biomedicals | ICN1860454 | |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Scientific | SH3002201 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2942 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used at 0.5% in cell culture media |
| Unidirectional Flow Clean Bench | Envirco | VLF 797 | Optional housing for keeping printer aseptic |
Referencias
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