准备个人果蝇蛋钱伯斯实时成像

1。 果蝇准备清扫前（据E. Gavis，普林斯顿大学） 丢弃从一个人烟稀少接种瓶的成年人和转让一瓶25°C在实验之前。一旦新的成年人已经开始出现，等待两天。 采取蝇小瓶含有固体食物大约10毫升添加0.5-0.7克干酵母（见附表），45度角。不飞食品用酵母覆盖整个表面。 酵母，加水几滴足以水合物（图1A）。放置在45度的小瓶，让酵母约3分钟，浸泡水（图1B）。 注：此外，预混料1酵母粘贴在一个单独的容器中，并用锅铲添加粘贴到小瓶。 麻醉注射CO 2气体在瓶中的苍蝇。当他们停止移动，刀尖上的CO 2无意识的苍蝇</sUB>排序（图1C）飞垫。 10-15女性在解剖范围和5所需的基因型的男性隔离用细尖的油漆刷（图1D）。男性存在claspers，一个黑暗的突出结构，在他们的后路，是明显的。 选择苍蝇添加到yeasted瓶（图1E）。在25°C的地方为24-60小时。孵育短的时间内为更多的年轻％，中期阶段蛋商会和较长时期后期鸡蛋商会。 （2） 果蝇的卵巢解剖放置一个1.5号，22×50毫米的盖玻片（图2A）的卤烃油小滴。将一边准备盖滑，它不会的方式。 麻醉注射到CO 2垫CO 2气体和小费在yeasted卑鄙的苍蝇。 用锋利的细鼻钳把握养肥个别女性在腹部前（不与日é腹部和胸部）（图2B-C的）。 女性用钳子举行，约2-3厘米以上的准备盖玻片，在解剖显微镜下查看。 前仍然持有，使用的第二套钳消除极端的女性后方（图2D）的组织。注：肠组织通常会与后端拉。擦拭钳取出的组织。 虽然仍保持前的女性，使用擦拭的镊子轻轻挤压或按摩腹部，前赶制的后路。按摩腹部，在同样的方式从管牙膏。 从腹部和棒钳（图2E – F）月底将被推迟两个大的不透明结构。这些都是成对的卵巢。 触摸到下面的幻灯片上的卤烃油的卵巢。 重复剥离1-2次，给予4-6卵巢在盖玻片上的油（FigurË2G）。 3。隔离卵巢管注：每个卵巢含有约16的6至10个鸡蛋像一个字符串10珠安排的不同阶段商会的卵巢管。 注：隔离卵巢管之前，调整解剖显微镜照明光源，使样品取得浅的角度。这使对比样品，让年轻的阶段蛋商会的可视化。 在石油，封闭钳（图3A）在后端（古戏台）通过消除连接组织分离的两个卵巢。 东方权左侧和最年轻的阶段最古老的阶段，个体的卵巢。年轻的阶段，在卵巢卵商会是透明的，形成卵巢尖底。 一双中占主导地位的手钳，轻轻抓住卵巢后，最好是由残余的日é结缔组织组织。按住钳发生卵巢，用解剖探头（或钨针），梳理出个别的卵巢管（图3B – D）。 注：个人卵巢管会之间的年轻阶段（germarium要举办10），打破旧的阶段是太大，无法从完整的卵巢中分离。 注：穿刺与解剖探头的后期阶段的卵母细胞，将导致入油泄漏的细胞质，使个别卵巢管的提取非常具有挑战性的。如果后期卵母细胞被刺破，移动到一个新的卵巢。 一旦卵巢管是免费的卵巢，用解剖的探头，将其拖动到油滴中心和实验所需的方向东方。注：油中的卵巢管会解决，并坚持以玻璃。 重复这个过程中（3.3-3.4），直到有15-25个人的卵巢管。注：这可能需要解剖multip乐卵巢。整个过程中应少于15分钟。 注：最好是几个苍蝇，而不是减少苍蝇双侧卵巢解剖实验，以增加N多的苍蝇从解剖各一个卵巢。 注：粗糙处理的卵巢管会导致不健康的卵母细胞，可导致实验中的文物。 注：卵母细胞就会开始显示，由于强调40分钟后，从卵巢解剖（比较图7E对F）的表型变化。 一旦卵巢管，在适当的方向（图3E），用解剖的探头和封闭镊子移动的石油过剩的卵巢组织。这种材料可以从镊子上的纸巾擦了擦。 4。隔离个别后期蛋商会（据E. Gavis，普林斯顿大学） 与一双镊子在domin蚂蚁的手，抓住一个孤立的卵巢后，最好是由结缔组织的残余。虽然在地方的镊子卵巢，引入后端的卵巢附近的镊子（图4A）的解剖探头。避免后期蛋商会之间插入探头穿刺任何蛋室。 转危为安卵巢解剖针，直到它退出在早期阶段蛋商会（图4B）。正确完成后，探测器将删除举行的卵巢管和后期蛋商会在地方的结缔组织。 重复步骤4.2，直到盖玻片上的卵巢管蔓延。注：当卵子商会不再堆放在彼此顶部，这一步完成。 使用解剖探头，后期卵母细胞分开，以便容易成像（图4C）。 注：穿刺卵母细胞，而解剖后期蛋商会是不是谴责与解剖我年轻的阶段ndividual卵巢管。 注：14阶段蛋商会，使用的镊子，把握方向背附属物。 5。注射剂注：对于中期阶段的卵母细胞注射，东方的卵巢管垂直于长轴的盖玻片。 打开成像显微镜[在我们的例子从应用精密DeltaVision核心和加载适当的成像设置（图5A-B的）。 打开的注射器具（图5C）。 加载装载尖（图5D-E），注射针头。被注入的解决方案应在高速离心简单，以避免存款，可能会阻止注射针。 将装的注射针注射器。照顾，以避免破坏针（图5F）。 协助畅通针，从伤口或破盖玻片1放置一个玻璃2X10毫米的小块油中含有的卵巢管下降的一个侧面。确保这个玻璃碎片被油覆盖。这种玻璃将成为打破或畅通针到RAM针尖对。 6。注射荧光RNA 开始之前：建立注射装置和微型机械手的控制等，注射针头，在视野的中心位置。 装载的样品被注入显微镜舞台上。 选择20X客观。也可用于更高或更低的放大率目标。 注：如果使用点访问功能自动化阶段，它是最好的，以纪念所有阶段开始前8-9注入卵母细胞。这允许容易访问和选定的卵母细胞的注射。 降低注射针，直到它触及油。中心在物镜的针尖。 转关闭房间的灯打开亮场显微镜的光。选择标记点的名单上的第一点（卵母细胞）。通过目镜的同时，重点对卵母细胞（图6A）。 手动降低针，直到它是在同一平面上的卵母细胞和可见光下的卵母细胞作为重点。 使用机械手的控制，移动，直到它的卵母细胞内注射针点。往往是一个快速刺向运​​动较缓慢前进的成功。一旦进入，退出从体积小针和视觉的效果进行评估，需要重复。如果注入成功，将卵母细胞的细胞质内流离失所，如果这不是明显的重复。这是没有必要的材料，以确定是否已注入荧光图像。注射后，取出卵母细胞内（图6B-G）的针。 注入流体的确切数额难以定量。为了增加注射量，佐剂ST的压力或注入脉冲的时间，打破了针尖略有增加开放或重复使用注射脉冲。 注意：整个注射过程中应采取正确执行时不到10秒。广泛刺伤或缠绵与针内卵母细胞，将导致严重损害蛋室。 在选择下一个显着的卵母细胞，提高高油注射针足够，以免联系其他的卵母细胞在旅行路径。 在新的卵母细胞，重复步骤6.6。这样，直到所有所需的卵母细胞注入。 注：如果出现错误，而注射，移动到下一个标记的卵母细胞。不要浪费时间对受损的卵母细胞。 注：针注射会议期间可能会成为堵塞。在这种情况下，将毗邻的玻璃碎片在盖玻片上的油针。风趣h的玻璃，并在同一焦平面的针，轻轻公羊玻璃针（图6H）。测试针推注射按钮，并看到如果任何液体退出针尖畅通。 当所有的卵母细胞已注入，手动移动的针，出油和显微镜的光路方向出来。确保它是在一个安全的方向，以避免损伤眼睛。 注：如果长时间蛋室隔离和卵母细胞注射后，卵母细胞将难以注入并表现出与压力相关的表型变化。粗糙处理的卵母细胞或注射过剩体积（比较图6I，J，K），可能会出现类似的问题。 7。实时成像实验设计从列表中选择首先注入卵母细胞。测试注入卵母细胞内成像荧光的一帧（图6G）。 配置实验参数，包括：激发波长，发射路径，激发时间，Z-Stack与集合之间的时间。注：欲了解更多这方面的资料，看到帕顿河，等。 （2010）2。 收集的数据集。 8。代表结果 在体外合成网站-546 GRK的RNA注射到Me31B :: GFP蛋腔（图7A）。 RNA的定位于背侧前的卵母细胞和细胞核周围形成了一个帽（图7B）。对于RNA的定位更多的例子，见麦克杜格尔N.等。 （2003年）11。 中期和后期卵母细胞表达荧光标记蛋白（TAU-GFP，图7C）或RNA标记系统（GRK * mCherry，图7D）可成像没有注射。 图1。 <p class="“jove_content”"> 图2。 图3。 图4。 图5。 图6。 图7。