Evaluación de la expresión de GFP y viabilidad mediante el Tali basada en imágenes citómetro

1. Tinción de las células con el kit de Viabilidad Tali – reactivo para la Red Dead De iniciar este procedimiento con células U2OS (American Type Culture Collection) que han sido transducidas con CellLight Núcleo-GFP * BacMam 2.0 *. (Nota: Las células también se pueden hilar y resuspendido en el medio o PBS). Para teñir las células muertas de PI, la transferencia de 100 L de las células a un tubo nuevo de microcentrífuga. Tenga en cuenta que una concentración de 1 x 10 5 a 1 x 10 7 células / ml se recomienda para este ensayo, aunque la concentración no tiene por qué ser exacta. A continuación, para teñir las células muertas, añadir 1 l de reactivo basado en IP Tali de glóbulos rojos muertos. Agitar brevemente para mezclar. Incubar el Tali muertos reactivo de glóbulos rojos y la mezcla de células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1-5 minutos. Tras la incubación, proceder de inmediato al análisis de la muestra en la imagen basada en Tali citómetro. 2. Realización de un ensayo de viabilidad celular El uso de unTali basada en imágenes citómetro El citómetro de Tali utiliza el plástico desechables Tali Diapositivas análisis celular que se ajuste específicamente en el citómetro y puede albergar dos muestras de 25μL por separado en cámaras cerradas (A y B). Al manipular la diapositiva, asegúrese de que siempre tienen a los lados. Para cargar la diapositiva, pipeta de 25 l de la muestra lentamente en la forma de media luna zona de carga de la muestra, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas o en la espalda salpicaduras. No más o menos llenar. En este caso, las células control (sin mancha, no transducidas) se cargan en la cámara A y el manchado GFP-que expresan las células se cargan en la cámara B. La muestra de control le ayudará a determinar el nivel de autofluorescencia en el análisis de los datos. Para llevar a cabo un ensayo de viabilidad, el tacto GFP / RFP en la pantalla principal del citómetro. Las opciones de análisis aparecerá a la derecha. Seleccione GFP + Viabilidad. A continuación, a nombre de la serie de muestras, presione nombre ahora </strong>. Luego, utilizando la pantalla táctil, escriba el nombre de la serie de muestras, y pulse Guardar. (Nota: Seleccionar Nombre Más tarde, para asignar automáticamente un nombre para cada serie de muestras por fecha y hora.) Después de nombrar a la muestra, el citómetro de Tali avanzará automáticamente a la pantalla de medida. Pulse la ficha de fondo en la parte derecha inferior de la pantalla de medición. A continuación, con la muestra de control (A) de espaldas a la citómetro, insertar la diapositiva en el puerto de carga hasta que se detenga. No aplique una fuerza. En la pantalla de fondo, toque Pulse para Insertar nuevo control celular sin teñir. La diapositiva de forma automática se detuvo en el citómetro y una imagen en vivo de las células se mostrará en la pantalla. Utilizando el botón de enfoque, traer las células en el plano adecuado de vista. Las células deben ser uniformemente oscuro, con un halo brillante alrededor de cada célula (Figura 1, izquierda). Células pueden ser contadas en la transición entre el fondo y los bordes de las celdas es confusa, por lo que los límites de la celda no están bien definidos (Figura 1, Centro). Las células pueden ser overcounted cuando tienen centros de brillantes y oscuros perímetros (Figura 1, derecha). Para ver mejor la población de células mientras que se centra, deslice el botón de zoom indicador rojo de 4X o 16X. Una vez que las células se han puesto de relieve, toque Pulse para ejecutar control de células sin teñir para medir la fluorescencia de fondo. El citómetro de automáticamente capturar y analizar las imágenes de la muestra. Se tarda aproximadamente 1 minuto para capturar y analizar las imágenes en el directorio predeterminado (9 imagen fija). Las miniaturas de cada campo de visión se muestran como son capturados y la barra de progreso se ofrece una actualización permanente. Después de la captura de imágenes se ha completado, el citómetro expulsa automáticamente la diapositiva y brinda los datos para el análisis de las imágenes capturadas. Los datos almacenados se mostrará en el menú desplegable de la ficha de fondo en el citómetro. La muestra de control de antecedentes se le asignará el mismo nombre que se da a la experiencia y se importarán en el menú desplegable. Nota: Si un control de fondo no se ejecuta, el citómetro asigna automáticamente un umbral de fluorescencia. Esto se puede cambiar manualmente después de realizar el ensayo. Para ejecutar el ejemplo PI teñido transducidas, eliminar la diapositiva del citómetro, darle la vuelta y vuelva a insertarlo con la muestra de transducción de espaldas al instrumento. Pulse la pestaña de la muestra, a continuación, toque Pulse para introducir nueva muestra. Cuando la imagen aparece en la pantalla, utilice el botón de ajuste de imagen para que las células en el foco que antes. A continuación, pulse Pulse para Ejecutar la muestra. Después de la captura de imágenes se ha completado, los datos de los análisis aparece en la pestaña de la muestra y el citómetro automáticoaliado expulsa de la diapositiva. Adecuada disposición de las diapositivas Análisis Tali celular como desechos. Tali Diapositivas análisis celular no se pueden reutilizar. 3. Establecer umbrales y puertas Una vez que la muestra se ha ejecutado, los umbrales de ahora se puede aplicar a la muestra a la casa en una población de células específicas. Aquí, vamos a ajustar los umbrales para determinar el porcentaje de células vivas y muertas en las buenas prácticas agrarias-las células transducidas. En la ficha de la muestra, el número y porcentaje de células que expresan GFP, células vivas y muertas que expresan GFP, la viabilidad total, el tamaño promedio de células, el número de células contadas, y la concentración de la celda se muestran. Además, el histograma de mostrar el tamaño de celda, la fluorescencia verde y rojo de fluorescencia (PI) se muestran en la parte inferior de la pantalla. Para configurar la puerta de tamaño de la celda, toque la miniatura de tamaño celular para abrir el histograma tamaño de la celda. Mientras que las células cultivadas rara vez tienen debris, otras muestras pueden contener restos del que sea más grande o más pequeño que las células. Para excluir estos desechos, deslice el botón azul en la barra deslizante para excluir a los eventos grandes y pequeños. A continuación, toque en Aplicar para volver a analizar los datos y actualizar los resultados. A continuación, añadir la fluorescencia de GFP en el análisis, toque la miniatura histograma GFP para abrirlo. Deslice la barra azul para establecer el umbral justo a la derecha de la más tenue de pico, con la muestra de control como guía. Esto permite el análisis para incluir las células GFP positivos, pero excluye las células autofluorescentes. Autofluorescencia se observa con frecuencia cuando las moléculas biológicas dentro de las células se excitan. Toque en Aplicar para confirmar y volver a la pantalla anterior. Los datos que se muestran en la pestaña muestra el momento de reflexionar las puertas y los umbrales establecidos para los dos canales de fluorescencia. A continuación, para separar las células PI teñido de autofluorescencia, pulse tque thumbnail PI histograma para abrir el histograma de PI. Una vez más, el pico de la muestra de control se muestra como un pico de color gris en el histograma. El pico de color rojo es la fluorescencia de la muestra. La fluorescencia de fondo se muestra como un pico más próximo al valor 0 RFU en este citómetro. Para eliminar la fluorescencia de fondo en el canal de PI, mueva el botón azul en la barra deslizante para ajustar el umbral para excluir el pico que representa la fluorescencia de fondo, con el pico gris de la muestra de control como referencia. Toque en Aplicar para confirmar y volver a la pantalla anterior. A continuación, para confirmar visualmente que cada célula está correctamente asignado, seleccione un campo de captura de vista para revisar pulsando la miniatura de la imagen en la ficha Zoom, a continuación, pulse la pestaña de Capas. A continuación, pulse el botón de las buenas prácticas agrarias o PI, para mostrar la imagen capturada a través de ese canal en particular. Pulse el mismo botón para eliminar la capa de la pantalla, o bien, para superponer capas, toque el botón de múltiples capas. Para identificar cómo las células se cuentan a través de un canal en particular, los círculos de contacto. Las células que se contaron únicamente a través del canal de campo claro, que no expresan fluorescencia será encerrado en azul. Esto indica que esa célula en particular es en vivo (es decir, PI negativas). Las células que expresan GFP se verá en el canal de las buenas prácticas agrarias, y será un círculo de color verde. Las células muertas teñidas con Red Dead Cell se verá en el canal de PI, y será un círculo en rojo. Células contadas, tanto en el canal rojo y el verde será un círculo de color amarillo, esto indica que la célula expresa GFP, pero también teñidas con PI y por lo tanto está muerto. En ocasiones, los círculos negro aparecerá en la pantalla, se trata de objetos que han sido identificados, pero han sido excluidos del análisis basado en el tamaño celular. Siguen fine ajustar el umbral en el histograma de fluorescencia utilizando los pasos que acabamos de describir hasta que cada célula que expresa la fluorescencia es un círculo con el color adecuado. Todos los parámetros de análisis se guardan automáticamente en la ficha de datos. El citómetro de Tali puede almacenar archivos de datos de alrededor de 500 carreras de la muestra. Cada archivo almacenado en la ficha de datos está disponible para su nuevo análisis. Al seleccionar el archivo de la ficha de datos, se le abre y todos los histogramas y las capas se activan. Para archivar datos y generar informes, los datos almacenados en el citómetro pueden ser transferidos a un ordenador mediante una unidad USB. 4. Los resultados representativos: La imagen basada en Tali citómetro se utilizó para medir el nivel de expresión de la proteína fluorescente en las células que se transduced con una construcción de armas nucleares dirigida GFP expresión BacMam 2.0. Cuatro tipos de células representativas fueron transducidas (U2OS, 293MSR, HEKn y CHO-S).Para estas líneas celulares, el número de células que expresaban GFP fue reportado por el citómetro de Tali y en comparación con los datos de las mismas muestras se analizaron en un citómetro de flujo. Además, las células fueron teñidas con reactivo para la Red Dead utilizando el Kit de Viabilidad Tali identificar a la población de células muertas, tanto en el citómetro de Tali y en un citómetro de flujo. Las representaciones gráficas de la Figura 2 muestra el porcentaje de la población total de cada tipo de células que expresaban GFP. Estos datos demuestran que el citómetro de Tali produce datos comparables a los datos generados por un citómetro de flujo. Figura 1. Las celdas deben estar debidamente centrado antes del análisis. Diapositivas Tali celular Análisis de las concentraciones de células adecuadas para el análisis (1 x 10 5 a 1 x 10 7 células se recomiendan). (Izquierda) en las células de enfoque son de manera uniforme darca en toda la célula, con un halo brillante alrededor de cada célula de la célula. (CENTRO) pueden ser contadas en la transición entre el fondo y los bordes de las células se ven borrosos y las células tienen límites indefinidos (DERECHA) Células quizá overcounted cuando tienen brillantes centros y los perímetros de oscuridad. Figura 2. Fluorescentes datos de expresión de proteínas de la citómetro Tali basada en imágenes es comparable a la obtenida mediante citometría de flujo. Una comparación lado a lado de calcular la expresión de GFP-los resultados en cuatro líneas diferentes de células en células viables.