Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP의 표현과 생존 능력의 평가
Summary
이 프로토콜은 Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 세포 생존 능력과 형광 표현 assays를 수행하는 방법을 설명합니다.
Abstract
단일 셀과 인구 정보는 일반적으로 유동세포계측법 또는 형광 현미경을 통해 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 두 가지 방법으로 다른 정보를 제공합니다. 유동세포계측법 물리적 특성과 얼룩이나 표현에 대한 정량 멀티 파라메 트릭 정보를 제공하지만, 시각화를 허용하지 않습니다. 독립 실행형 형광 현미경 시각 데이터를 제공하지만, 간단 양적 측정 1 허용하지 않습니다.
이미지 기반 cytometry는 이기종 인구 2 세포의 수천의 빠른 시각화 및 동시 정량 분석을 가능하게이 두 가지 방법 사이의 격차를 다리. 여기, 우리는 Tali 이미지 기반 Cytometer 3를 사용하여 세포 생존과 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현식 assays을 수행하기위한 방법을 제시한다. Tali 악기는 3 채널 (명시야, 녹색 형광 빨강, 형광) benchtop 분석 플랫폼입니다 offe유동세포계측법 및 형광 현미경을 통해 RS 여러 장점. Tali의 cytometer은 저렴 적은 벤치 공간을 차지하고, 적은 유지 보수가 필요하고, 작업 흐름 작업 및 분석이 훨씬 더 간단하고 더 빨리되도록 간소화되었습니다. Tali의 cytometer은 GFP 형광 단백질과 빨간색 (RFP) 표현, apoptosis 4-6 및 propidium 요오드화물의와 세포 생존 능력 분석 (PI) 7-11 포함한 정지 셀 기반 assays의 범위를 수행할 수있다.
여기, 우리는 GFP를 표현 세포에서 세포 생존 능력 분석을 수행 Tali 악기의 사용을 보여줍니다. 죽은 세포 레드 – GFP – transduced 세포는 Tali의 생존 키트를 사용하여 얼룩 있습니다. 세포는 다음 Tali 셀룰러 분석 슬라이드로 pipetted 및 cytometer로로드됩니다. 명시야, 빨간 형광 녹색 형광 이미지 캡처 및 분석 특정 알고리즘을 사용하여 분석하고 있습니다. Histograms 그러면 셀 크기, PI fluo를 표시하려면이 생성됩니다rescence 강도 및 GFP 형광 강도. 이러한 매개 변수는 다음 특정 셀 인구에 고향 thresholded 수 있습니다.
사이드가로 Tali 이미지 기반 Cytometer 전통 유동세포계측법의 측면 비교 두 가지 방법이 세포 생존 및 단백질 표현에 관한 비교 가능한 데이터를 제공 보여줍니다. 그러나, Tali 악기는 흐름 cytometer를 사용하여 얻을 수없는 세포 인구에 대한 추가 시각 정보를 제공합니다.
Protocol
Discussion
우리는 생존 카운트를 수행하고 Tali 이미지 기반 Cytometer를 사용하여 GFP 발현을 평가하기위한 절차를 상세있다. 동일한 절차를 사용하여,이 cytometer을 포함한 다른 assays의 숫자를 수행 가능합니다 : 비 transduced 세포를 사용하여 apoptosis, RFP 및 세포 생존 능력 분석.
세포 생존, 유전자 발현 및 apoptosis의 Fluorometric assays는 생물 의학 연구 7-12의 주요 방법론되고 있습니다. 과거, 별도의 장비에있는 세포에 대한 양적 및 시각 정보를 얻는 데 사용되었습니다. 이종 인구 내에서 세포에 대해서 양적 정보 유동세포계측법의 사용을 통해 얻고있는 동안, 영상 또는 질적 정보는 형광 현미경 1-4 사용을 통해 수집되었습니다. 여기, 우리는 인구 및 개별 세포 연구 사이의 격차를 다리 기술을 제시한다. Tali 이미지 기반 Cytometer, 양적 다를 사용하여타 개별 셀 또는 셀 집단에 대한 시각적 셀 데이터를 동시에 수집하실 수 있습니다. Tali 악기는 유전자 표현의 평가, apoptosis의 assays, 마약 효능 연구 및 질병 진행의 평가를 포함하여 응용 프로그램의 범위에 사용될 수 있습니다.
Tali 이미지 기반 Cytometer 캡처하고 세포의 subpopulations에 대한 정보를 얻을 수 있도록, 밝은 필드 빨강, 형광 녹색 형광 이미지를 분석합니다. 예를 들어,이 분석에서 우리는 죽은 세포 빨간 염료를 사용하여 GFP – 표현 세포 인구 내에서 라이브 세포에서 죽은 세포를 구별할 수 있었다. 이 GFP를 표현 가능한 세포의 측정 정확도를 제공하고, 다운 스트림 처리를위한 유용한 세포의 인구를 나타냅니다. 인구에있는 죽은 세포가 환경 조건 (예 : trypsinization 또는 취소로 인한 정상적인 문화의 세포 사망 또는 세포 사망 등 다양한 소스로부터 발생할 수있는 점에 유의하는 것이 중요하다) 선택한 transfection / 도입 방법으로 유도 ath.
여기 U2OS 세포와 Tali의 cytometer의 사용을 보여줍니다. 비슷한 방법은 대부분의 포유 동물과 곤충 세포를 사용하여 수행할 수 있습니다. 각 세포주의 경우 Tali의 cytometer은 양적 GFP 발현 데이터 표준 형광 현미경을 사용하여 세포의 육안 검사와 수 없습니다을 생산. 이러한 결과는 유동세포계측법 비교할 수 있지만, 그들은 시간의 일부 수집하고 있습니다. cytometer은 이상 한 X 10월 5일부터 1일까지 X 10 7 세포 / ML의 농도에서 직경 60 μm의 5 μm의 사이에 정확하게 계산 세포 수있다.
그것은 죽은 세포 붉은 얼룩 프로토콜 여기에 설명된 내용을 포함한 대부분의 표준 얼룩 프로토콜을 지적하는 것이 중요합니다, 라이브와 죽은 세포를 구별할 propidium 요오드화물을 사용합니다. 세인트에 대한 permeabilized되었습니다 세포의 생존 능력을 평가 때 도전을 선물PI가 손상된 멤브레인있는 모든 세포를 얼룩 때문에, 세포 마커 aining. 녹색 또는 빨간색 형광 채널로 감지할 수있는 형광 염료이나 단백질이 Tali 이미지 기반 Cytometer에서 분석할 수 있기 때문에 미래의 연구는 아민 반응 생존의 염료 4와 같은 대체 염료의 사용을, 탐험 수 있습니다. Perfetto 외에 의해 2006 년 연구. 12이 염료가 생활하고 죽은 세포 인구를 차별에서 사용하기 쉽고 재현할 수 발견했습니다.
Tali 그것이 수행할 수있는 assays의 종류에 관한 제한을 가지고 있습니다. 악기가 사용하는 목적 4X이기 때문에 예를 들어, 계산 작업은 큰 세포 유형으로 제한됩니다 같은 mitochondria 또는 vesicles 같은 하위 세포 구조 및 박테리아 세포는 계량하실 수 없습니다. 또한 Tali에서 감지 채널 Excite와 채널 내에서 방출됩니다 fluorophores로 제한됩니다. 동안 YFP 밝은 mCherry 신호 C가 감지, 주차 mCherry 신호 수 없습니다. 마지막으로, Tali은 정지 세포를 분석합니다. 그것은 정확하게 슬라이드에 준수 세포를 카운트하지 않습니다. 또한, 일부 효모 및 기본 세포를 포함하여 불규칙 모양 세포를 계수에 대해서만 제한 기능이있는 동안.
또한, 향후 연구 가능성이 세포 마커의 표현을 평가하는이 시스템의 사용을 주소로합니다. 개인 염료는 Invitrogen의 온라인 SpectraViewer 도구 (사용하는 인접 채널 스펙트럼 중복에 대해 확인하실 수 있습니다 www.invitrogen.com / spectraviewer을 ). 이 기술의 새로움 감안할 때, 애플 리케이션의 전체 범위는 발견되지 않았다.
요약에서 Tali 이미지 기반 Cytometer 여기서 보여주는 개별 세포의 평가뿐만 아니라 cel을 활성화, 세포 인구의 동시 시각화 및 분석을위한 수있는 새로운 기술을 제시간단한 워크플로우와 소형 형식으로 내 인구.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 |
| Tali Viability Kit – Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 |
| U2OS cells |
Referencias
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