옥내 핵산 흐름 Cytometry - 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션 (LNA 흐름 - 물고기) : 세균의 소형 RNA 감지하는 방법

1. LNA 프로브 및 실험 설계 귀하의 베꼈는데 sRNA / mRNA의 반대로 보완거나 그들에 사용자 정의 설계 디자인 LNA 프로브 www.exiqon.com . 사용자 정의 디자인 옵션을 사용하면 순서를 알아,하지만 LNA의 급상승 패턴하지 않습니다. 사이의 T m의 증가에 DNA 또는 RNA oligonucleotide 결과에 각 LNA 잔여물의뿐만 아니라, 둘, 10 ° C LNA – RNA의 하이브 리다이 제이션 이중 14. 이상적으로, 설계 LNA 프로브의 길이는 20-25 세포핵 (이상 프로브는 종합 더 어렵습니다) 사이와 85-90 사이의 T m ° C RNA에 대한이 하이브 리다이 제이션 있어야합니다. 순서를 설계 후, 폭발을 사용 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi를 하거나 프로브는 여러분의 sRNA / 관심의 mRNA에 따라 다릅니다 수 있도록 로컬 데이터베이스에 프로브 시퀀스를 비교합니다. LNA 프로브를 주문하면, LNA의 oligonucleotide의 5 '끝에 비오틴 – TEG 수정을 추가합니다. biotinylation은 streptavidin 염색 활용과 사후 하이브 리다이 제이션 얼룩 필요합니다. 그것은 3이 수정을 추가할 수 있습니다 '필요하면 끝, 그러나 5 추가'끝이 저렴하고 높은 수율을 초래한다. 세 가지 부정적인 컨트롤 방법에 포함되어야합니다 (I) LNA 프로브는 하이브 리다이 제이션 단계에서 추가되지되는 '아니오 LNA'통제하고, (ii) '아니오 염료'컨트롤이있는 LNA 프로브가에 hybridized입니다 대상 sRNA하지만 하이브 리다이 제이션 이벤트가 형광 얼룩의 부재로 인해 탐지하고, 순서에 존재하지 않는 또는 비 표현 sRNA을 대상으로 LNA 프로브를 이용 (3) '이외의 표현 sRNA / mRNA'제어하지 않습니다 불특정 하이브 리다이 제이션을 모니터링합니다. 여기에 구체적인 LNA의 프로브 (LNA의 단량체의 sRNA CsrB를 보완하고 '5' – 비오틴 – TEG – gTccAttTccCgtCctTagCagC – 3 순서를 가지고) 문자를 대문자로. -20 ° C.에 10-20 μL aliquots에서 50 μg / ML 및 저장하는 nuclease 무료 물로 resuspend 동결 건조된 LNA 수령, 다음 솔루션 8퍼센트 paraformaldehye (pfa), PBS에서 10 % 초산 : 믹스 1 ML 32% pfa, 400 μL 초산, 400 μL 10X PBS, 산도 = 7.4, 그리고 2.2 ML nuclease없는 물. 냉동 aliquots 들어, 초산없이 -20 ° C에서 단일 사용 aliquots에서 동결. 60% dextran 황산 솔루션 : 50 ML 원뿔 튜브 6.0 g dextran 황산을 추가하고 10 ML의 최종 볼륨에 물을 추가할 수 있습니다. dextran 황산은 (1-2 시간 걸릴 수 있습니다) 해산되기 전까지 ° C 물 목욕에 65이 혼합물을 가열. 추가 물 10 ML 볼륨을 유지하기 위해 solubilization 과정에서 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전까지 -20 ° C에서 나누어지는 60% dextran 황산 솔루션과 저장합니다. 2. 정치 발광 생물의 수확 1×10 8 셀 <em> 장염 campbellii 또는 세균 관심 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 그들을 전송합니다. 세포의 수량이 네 흐름 – 물고기 샘플 (한 특정 LNA 프로브 샘플과 세 부정적인 컨트롤)에 대한 충분한 시작 자료를 제공합니다. 다른 sRNA / mRNA 종의 테스트해야 할 경우 추가 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 aliquots가 수집되어야합니다. 펠렛 5 분 동안 2,300 XG에서 원심 분리하여 세균 세포. pipetting하여 뜨는을 취소하고 1X PBS 400 μL의 세포를 resuspend. 이 혼합하려면, (1X PBS) 솔루션을 식염수 버퍼 잘 혼합 1X 인산염의 8 % paraformaldehye (pfa)와 10 %의 아세트산 400 μL를 추가, 25 10 분 동안 품어 ° C 5 분 후에 한 번 혼합. 별도로 명시하지 않는 한 모든 incubations은, 가열 튜브 홀더에서 수행됩니다. pfa 솔루션은 신선한 준비 또는 초산의 추가 후 냉동 aliquots에서 사용해야합니다. Paraformaldehyde는 crosslinking의 정착액입니다 Helps은 세포 형태를 유지하고 세포내 RNA를 유지합니다. 펠렛은 2 분 동안 4,500 XG에서 원심 분리하여이 혼합물의 세포와 pipetting하여 뜨는을 제거합니다. 원심 분리가 필요한 모든 미래의 단계가 동일한 설정 (7K, 2 분)을 사용해야합니다. supernatants가 pipetting과 decanting하지 의해 제거되어야한다는 다음 원심 분리에 유의하는 것이 중요합니다. 400 μL 1X PBS로 두 번 세포를 씻어 400 μL 1X PBS의 마지막 셀을 펠렛을 resuspend. 세포는 현재 고정되고 ° C 400 μL 1X PBS에서 최고 7 일 동안 4 저장할 수 있습니다. 3. 디에틸의 pyrocarbonate 처리 1X PBS (400이 솔루션의 μL 따라 너무 규모의 테스트로 모든 샘플이 필요합니다)에 디에틸 pyrocarbonate (DEPC)의 0.1 % 용액 400 μL를 준비합니다. DEPC 용액은 DEPC 주식 신선한 준비되어야합니다. DEPC 처리는 carbethoxylation로 RNases을 inactivates하고을 감소배경 신호. 각 고정 세균 세포 샘플에 0.1 % DEPC 용액 400 μL를 추가하고 pipetting으로 잘 섞는다. 십이분 25 ° C에서이 혼합물을 품어. 400 μL 1X PBS, 펠렛 세포 (7K, 2 분)와 두 번 세포를 세척 뜨는을 제거하십시오. 4. Permeabilization 1.0 MG / ML 솔루션 1 ML – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 트리스 버퍼 (10 MM 트리스, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0)에 라이 소 자임 1.0 MG를 추가합니다. 이 솔루션은 신선 준비하여야한다. 25 800 세포에 MG 1 / ML 라이 소 자임 솔루션 μL, pipetting에 의해 철저하게 믹스와 부화를 추가 ° 가끔 믹싱과 30 분 C. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 라이 소 자임은 세균 세포 벽의 peptidoglycan 선물 hydrolyzing하여 permeabilization 시약의 역할을합니다. TE 버퍼에 proteinase K의 3.0 μg / ML 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 -20 ° C.에 저장된 20 밀리그램 / ML proteinase K 주식 신선한 준비한다Proteinase K는 단백질의 다양한 소화하고 RNA에 프로브 및 시약의 접근을 도와주는 세린 프로 테아제이다. 3.0 μg / 세포 펠렛에 ML proteinase K 용액 800 μL를 추가하고 pipetting에 의해 철저히 섞는다. 부화를 통해 중간 vortexing와 함께 15 분 동안 25 ° C에서 품어. 펠렛 전지 (7K, 2 분), 뜨는을 제거하고 400 μL 1X PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 세차 뜨는을 제거한 후, 400 μL 1X PBS에서 세포를 resuspend과 네 개의 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 resuspension 100 μL를 추가합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 5. 이종 교잡 각 샘플에 대한 하이브 리다이 제이션 버퍼 (HB) 100 μL를 준비합니다. HB는, 부피, 질량 10 % dextran 황산 (매 100 μL에 대한 60% dextran 황산 솔루션의 16.7 μL 추가), 1X Denhardt의 솔루션, 50 MM 나트륨 인산 산도 7.0에서 50 %의 포름 아미드로 구성됩니다2X 나트륨 구연산 (SSC), 가지각색 연어 정자 DNA (SSSD) 및 20 μg의 효모 tRNA 20 μg. HB의 각각의 구성 요소는 서로 다른 목적을 가지고 있습니다. 포름 아미드가함으로써 RNA의 변성 및 세포 손상을 최소화 도와주는 핵산 duplexes의 녹는 온도를 낮춰줍니다. Dextran 황산은 볼륨 제외 폴리머는 프로브를 집중하고 하이브 리다이 제이션 속도를 높일 수로 사용됩니다. Denhardts 솔루션은 효모 tRNA와 SSSD가 아닌 특정 바인딩을 줄이기 위해 차단 대리인 역할을합니다. 세포의 각 resuspension 함유 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브를, 95 μL HB 및 sRNA /의 5.0 μL 추가 mRNA를 특정 LNA 또는 물 (LNA 대조군을위한) [특정 LNA 최종 농도 20 pmol]. 예를 들면 다음과 같습니다 튜브 1-95 μL HB + 5.0 μL sRNA / mRNA 특정 프로브 튜브 2-95 μL HB + 5.0 μL sRNA / mRNA 특정 프로브 ( '없음 염색'부정적인 제어) 튜브 3-95 μL HB + 5.0 μL sRNA/ mRNA 프로브 ( '비 표현 sRNA / mRNA'부정적인 제어) 튜브 4-95 μL HB + 5.0 μL 물 ( '없음 LNA'부정적인 제어) 60 분 60 ° C에서 네 명 모두 샘플을 품어. 하이브 리다이 제이션 온도는 LNA 프로브 (S) T m에 따라 차이가 있으며, 약 30 설정해야합니다 ° C 어닐링 RNA에 대한 T m을 예측 아래. HB의 상승 하이브 리다이 제이션 온도와 포름 아미드 모두 sRNA이나 관심 mRNA의 이차 구조의 변성을 보장합니다. 6. 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다 하이브 리다이 제이션 다음, 하이브 리다이 제이션 혼합물에 0.1 % 십대 초반 – 2​​0 (SSCT)와 1.0 ML 0.1X SSC를 추가합니다. 이것은 세포가 점성 하이브 리다이 제이션 용액에서 제거 수 있도록하는 것이 필요합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 50 %의 포름 아미드 200 μL, 2X SSC, 0.1 %를 추가 십대 초반 – 2​​0 세포 산탄으로, 철저하게 혼합 incub65 ° C 가열 블록에 30 분 먹었다. 혼합물, 펠렛 세포 (7K, 2 분) 1 ML 0.1X SSCT를 추가하고 뜨는을 제거하십시오. 세포를 resuspend하고 열 블록 65 40 분 ° C에 대해 품어 500 μL 0.1X SSCT을 추가합니다. 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 7. 차단 및 염색법 차단 버퍼 (BB)와 streptavidin 염색 얼룩 솔루션을 준비합니다. 5 배 주식 (상용, 시약 참조)에서 1X BB 솔루션을 준비합니다. 네 튜브의 모든 집합에 대해, 1.2 ML 1X BB를 준비합니다. 세포 펠렛, resuspend 200 μL 1X BB를 추가하고 25 30 분 품어 ° C. streptavidin – 복합 염료는 biotinylated LNA 프로브를 감지하는 데 사용됩니다. 차단하는 동안, 2 μg / ML DyLight 488 streptavidin 또는 30 분 (세명 샘플, 300 μL을)에 대한 1X BB에서 원하는 염료 streptavidin 활용의 솔루션을 준비합니다. incub 후1X BB, 펠렛 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거와 함께 ation. , 셀 알약에 streptavidin – 염료 용액의 50 μL를 추가 철저하게 혼합, 25 12 분 동안 품어 ° C 소용돌이 또는 thermomixer에 지속적인 혼합과 함께. '아니오 염료'제어를위한, 50 μL 1X 차단 버퍼를 추가합니다. 프로토콜의 나머지 들어, 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 튜브를 보호합니다. 500 μL 0.1X SSCT 버퍼와 한번 세포를 씻고 한 번 400 μL 1X PBS와 함께 0.1 % 십대 초반 – 2​​0 (PBST). 펠렛은 세포 (7K, 2 분)과 뜨는을 제거하십시오. 초기 streptavidin – 공액 얼룩 다음, 신호가 streptavidin 염색 활용에 biotinylated 방지 streptavidin 항체를 소개하고 (그림 2) hybridized LNA 프로브 당 신호 출력을 증가 따라서 streptavidin 염색과 두 번째 시간을 얼룩에 의해 증폭됩니다 . 1 μg / ML 100 μL를 추가 1X PBS, resuspen에 방지 streptavidin 항체를 biotinylated25 D는 세포, 그리고 품어 ° C를 가끔 믹싱과 함께 30 분. 펠렛 전지 (7K, 2 분), 뜨는을 제거하고 400 μL 1X PBST로 두 번 씻는다. 2 μg / 세포 ML streptavidin 염색 용액의 50 μL를 추가, 철저하게 혼합, 25 12 분 동안 품어 ° 소용돌이 또는 thermomixer에 지속적인 혼합과 C. '아니오 염료'제어를위한, 50 μL 1X 차단 버퍼를 추가합니다. 500 μL 0.1X SSCT 버퍼와 한번 세포를 씻어 한번와 400 μL 1X PBST. 4 200 μL 1X PBST와 저장소의 세포를 Resuspend ° C 유동세포계측법 분석 준비까지. 작은 박테리아 세포의 핵심 크기를 감소 느린 흐름 속도가 설정할 수 있습니다. 또한, 앞으로 산란 임계값 cutoffs와 흐름 cytometers위한 컷오프가 작은 세균의 세포가 감지되도록 가능한 낮은 설정해야합니다. DyLight 488 감지, 흐름 cytometer은 488 nm의 레이저 및 표준 방출을 갖추고 있어야FITC를위한 필터. 최소한 2×10 4 이벤트가 수집되어야합니다. 다른 레이저가 장착된 흐름 cytometers과의 호환성을 위해 다른 streptavidin – 복합 fluorophores이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 8. 대표 결과 고정하고 효과적으로 permeabilized 아르 세포의 예제는 그림 3A에서 유동세포계측법의 도트 음모에 표시됩니다. permeabilization에 대해 위에서 설명한 조건을 사용하는 경우, 세포 인구가 작고 동질적인 나타내는 몇 가지 세포 집계입니다. 라이 소 자임 높은 (5 밀리그램 / ML) 농도를 사용하는 경우 전지 집계 가능성이 더 높습니다 그리고 큰 입자 (그림 3B)을 나타내는 전방 산란 증가 값을 보여줍니다. 성공적인 LNA 흐름 물고기 실험에서 유동세포계측법 데이터의 예제는 그림 4에 표시됩니다. 히스토그램 세 부정적인 컨트롤과 함께 대상 sRNA의 특정 감지를 보여줍니다.'아니오 염료'부정적인 통제는 '노 LNA'과 '비 표현 sRNA'부정적인 컨트롤 다음에 적어도 형광을 생산하고 있습니다. 마지막으로, sRNA 특정 LNA 프로브와 샘플이 최고의 형광을 생산하고 있습니다. 방법과 LNA 프로브가 이러한 방식으로 확인되면, 추가적인 실험은 돌연변이나 다양한 문화 환경 등에 대한 응답으로, 시간이 지남에 따라 sRNA 신호의 변화를 모니터링하기위한 수 그림 1. 박테리아 sRNA의 검출을위한 LNA 흐름 물고기 실험의 전반적인 계획의 묘사. 그림 2. LNA 흐름 생선 신호의 얼룩 및 증폭. biotinylated LNA 프로브의) 하이브 리다이 제이션. 형광 DyLight 488 streptavidin의 활용과 함께 B) 염색법. C) biotinylated 방지 s의 바인딩DyLight 488 streptavidin에 treptavidin 항체. 항체는 항원 결합 사이트를 통해 streptavidin을 바인딩할 수 또는 비오틴 잔류물을 통해 streptavidin 구속 수 있습니다. 형광 DyLight 488 streptavidin의 활용과 함께 추가로 얼룩에 의해 신호의 D) 증폭. 그림 3.) 1 MG / ML 라이 소 자임, 3 μg / ML proteinase K permeabilization와 B) 5 밀리그램 / ML 라이 소 자임, 3 μg / ML proteinase K에 permeabilization에 대한 측면 산란 결과 비교 전달 보여주 유동세포계측법의 도트 플롯. 그림 4. LNA 흐름 생선 결과의 히스토그램 분석. 각 샘플에서 생성된 형광 신호가 네 가지 성분에 의해 표시됩니다 : 블랙 – sRNA 특정 LNA 프로브, 빨간색 – '비 표현 sRNA'부정적인 제어, 파랑 – '없이 LNA'부정적인 제어, 보라색 -'아니오 염색'부정 제어할 수 있습니다.