نظام الحرير ثقافة السينما ل في المختبر تحليل وتصميم مادة بيولوجية
Summary
الأفلام الحرير هي فئة جديدة من المواد الحيوية للتخصيص بسهولة لمجموعة من التطبيقات الطبية الحيوية. الفيلم الحرير قدم نظام ثقافة قابلة للتكيف للغاية لمجموعة متنوعة من<em> في المختبر</em> التحليلات. هذا النظام يشكل منصة تصميم مادة بيولوجية الطرح<em> في المختبر</em> التحسين قبل ترجمة مباشرة لل<em> في الجسم الحي</em> نماذج.
Abstract
الأفلام الحرير واعدة البروتين على أساس المواد الحيوية التي يمكن أن تكون ملفقة مع الدقة العالية واقتصاديا ضمن بيئة 1،2 البحوث المختبرية. هذه المواد تكون مرغوبة لانها تملك التحكم الى حد كبير خصائص الابعاد والمادية، وموافق للحياة وتعزيز التصاق الخلية، ويمكن تعديلها من خلال الزخرفة الطبوغرافية أو عن طريق تغيير كيميائيا على السطح، ويمكن أن تستخدم كمستودع للجزيئات البيولوجية النشطة للطلبات المتعلقة بالمخدرات 3-8. وبالإضافة إلى ذلك، والأفلام الحرير هي واضحة نسبيا لتصميم العرف، ويمكن أن تكون مصممة على حل في غضون دقائق أو تتحلل على مدى سنوات في المختبر أو في الجسم الحي، ويتم إنتاج مع فائدة إضافية تتمثل في أن يكون شفافا في الطبيعة، وبالتالي مناسبة للغاية لتطبيقات التصوير 9 – 13. منهجية نظام الثقافة المقدمة هنا يمثل نهجا قابلة للتقييم السريع للفيلم سطح الخلية والحريرالتفاعلات. أهمية خاصة هو استخدام الأفلام سطح الحرير المزخرف لدراسة الاختلافات في تكاثر الخلايا والاستجابات من الخلايا لمحاذاة 12،14. تم زرعها على ثقافات المصنف على كل صغيرة منقوشة ومسطح ركائز فيلم الحرير، ومن ثم تقييمها من خلال التصوير المرحلة على النقيض من الوقت الفاصل، المجهر الإلكتروني، وتقييم البيوكيميائية من النشاط الأيضي ومحتوى حمض النووي. وباختصار، فإن فيلم الحرير في منظومة ثقافة المختبر يوفر الإعداد للتخصيص التجريبية مناسبة لدراسة سطح الخلية التفاعلات على ركيزة مادة بيولوجية، والتي يمكن بعد ذلك أن يكون الأمثل ومن ثم ترجمتها إلى نماذج في الجسم الحي. ويجري حاليا استخدام نظام الملاحظات ثقافة المقدمة هنا تستخدم للمساعدة في تطبيقات تتراوح بين التفاعلات الخلية الأساسية لتصميم الجهاز الطبي، وبالتالي فهي ذات الصلة لمجموعة واسعة من المجالات الطبية.
Protocol
Discussion
وقد اكتسب استخدام الأفلام الحرير مجدد باعتباره ركيزة للثقافة خلية في شعبية على مدى العقدين الماضيين نتيجة لتوصيف واسعة من الخصائص المادية لهذا البروتين وزيادة الفهم للمادة بيولوجية لها فائدة 3،8. نظام الثقافة وصفها هنا يمثل رواية في نظام الاختبار في المختبر لتقييم التفاعلات سطح الخلية على الحرير المزخرف ركائز بيولوجية فيلم 7. ويتيح هذا النظام في تحليل معمق لالتفاعلات الخلوية مع مرور الوقت التي يمكن اعتمادها بسهولة لجمع البيانات عالية الإنتاجية. يتم تمكين هذا إلى حد كبير لأن الأفلام الحرير امتلاك عدد من الخصائص مادة بيولوجية الانضباطي التي يمكن تعديلها لتؤثر بشكل مباشر على وظيفة الخلية 8،9،12، بما في ذلك: السيطرة على سطح مايكرو / نانو سطح تضاريس 7؛ كيمياء السطح المختلفة من خلال تعديل التساهمية أو الامتزاز من جزيئات بيولوجية نشطة 13؛ الميكانيكية قويanical خصائص 15،16، والرقابة على المواد hydrophilicity / hydrophobicity 16؛ تحميل الجزء الأكبر من المركبات البيولوجية للافراج 4،8،17، وانحلال للرقابة / معدلات التحلل الأنزيمي من خلال السيطرة على هيكل ثانوي (بيتا محتوى ورقة) 11،18،19 .
ويتم تحقيق الشفافية في الأفلام الحرير من خلال الصلب الأفلام لفترة من الزمن في ظل فراغ في وجود بخار الماء 7،15. هذا النهج تجهيز يسمح لتشكيل β ورقة هيكل الثانوي، وتعزيز الذوبان من المواد في المياه في الوقت الذي تسمح حيود الحد الأدنى للضوء 15. هذه الشفافية من الأفلام هو مفتاح الحل في تمكين المباشرة الحية الخلية التصوير التي يمكن استخدامها في إطار عدد من طرائق التصوير (أي واسع المجال ومضان) باستخدام أي عدد من النظم مجهر 12،20. بالإضافة إلى التصوير الخلية الحية، ويمكن إزالتها بسهولة أفلام الحرير من اله نظام الثقافة للسماح لتثبيت إضافية وتحليلها. وهكذا، فإن مجموعة كبيرة ومتنوعة من التقييمات التجريبية المباشرة التي يمكن القيام بها في هذا النظام هي التي تنطبق على مجموعة واسعة من الخلايا / الأنسجة مصادر لكثير من المجالات الفنية 3،8،9،12،13،21. في الوقت الفاصل بين نتائج التصوير توضيح كيف يمكن جمع البيانات ثقافة في الوقت الحقيقي، وكما استخدمت مثال لتوضيح كيفية تضاريس سطح الخلية يؤثر على التفاعلات. نتائج ممثل توضح كيف يمكن استخدام المواد الحيوية فيلم الحرير لدعم HCLE نمو الثقافة، وقابلة للتعديل لعدد من الانتشار الخلوي القياسية والمقايسات الأيض (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يتم إصلاح الثقافات ومعالجتها لمسح التصوير الإلكتروني أو غيرها من البروتوكولات (الشكل 3).
ويتم إنتاج فيلم ركائز الحرير في المختبر مع الدقة العالية، والاتساق، وبتكلفة منخفضة نسبيا (الشكل 1) وهذا يتيح reproduciبيليتي في كل ثقافة إعداد النظام والنتائج التجريبية. وقد ثبت أن المياه يصلب معالجة تنتج فيلم الحرير مادة مستقرة داخل الثقافة التي حددت معدلات التدهور في انتظار تركيز البروتياز في حل 2،15،22. ونتيجة لذلك قد تستخدم هذه المواد لفترات طويلة من الوقت لزراعة الخلايا على المدى الطويل، أو لا تزال تزرع لشهور أو سنوات تبعا لموقع الفسيولوجية 8. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الأعمال الأخيرة أن كلا من بنية البروتين وخصائص المواد من الأفلام الحرير المياه صلب تتفق من حزمة إلى أخرى مما يسمح للنتائج ثقافة استنساخه كما هو مبين من خلال مختلف طرق الاختبار الميكانيكية والفيزيائية الحيوية 15،16. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت سطح المادة والاخلاص الكبير بين دفعات الفيلم كما هو مبين من قبل، ووزارة شؤون المرأة micrscopy القوة الذرية (فؤاد)، ودراسات ثقافة خلية {لورانس: 2008wr، Omenetto: 2008tc، براي: 2011kq} 7،23،24. مادة stabilإيتي والاتساق هو عامل مهم لكيفية خلية لن تشعر الركيزة ثقافة من خلال مسارات mechanotransduction مختلفة، وتنتج في نهاية المطاف الاستجابة المطلوبة / غير مرغوب فيها الخلوية 25،26.
المعايير التاريخية لركائز الثقافة، مثل البلاستيك زراعة الأنسجة المعالجة أو الزجاج، وتوفير ركائز كافية لمرفق الخلية. ومع ذلك، فإن هذه المواد ليست قابلة للتعديل للفائدة أخرى في الجسم الحي. ويمكن تصور أنه يمكن تخصيصها من الحرير فيلم مادة بيولوجية في المختبر، ومتى تحققت التوقعات التجريبية يمكن للفيلم مخصص ترجمة مباشرة إلى نموذج في الجسم الحي. مثل تصميم تقرن بين في التجارب المختبرية والتجارب المجراة يوفر ميزة كبيرة لمثل هذه المواد الحيوية الحرير زرع أكثر من ركائز الأخرى التي تستخدم عادة في المختبر.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة K08EY015829، R21EY019561، R24EY015656، P41 EB002520، وR01 EY020856 بحوث لمنع العمى جائزة التطوير الوظيفي، وثلاثي المؤسسية مبادرة الخلايا الجذعية. HCLE خط خلية قدمت مجاملة من الدكتور إيلين Gipson. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Aihong ليو في كلية طب وايل كورنيل للحصول على المساعدة التقنية والتوجيه لها مع ثقافة الخلية، أنتوني Labissiere في مستشفى الجراحات الخاصة للحصول على المساعدة التقنية لها مع التصوير ووزارة شؤون المرأة، المورد مركز هندسة الأنسجة (TERC) في جامعة تافتس للدعم التقني مع التطور المادي، ومركز كورنيل للعلوم النانومترية الحجم ومرفق التكنولوجيا (كنف) للمساعدة في تصنيع رقاقة السيليكون.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number |
| Silk cocoons | Tajima Shoji Co., LTD. | NA |
| PDMS monomer and cross-linker | Momentive | RTV615A 01P |
| Sodium Carbonate | Sigma | S2127 |
| Lithium Bromide | Sigma | 213225 |
| Slide-A-Lyzer | Thermo Scientific | 66110 |
| 1 mL Syringe | Becton-Dickenson | 309602 |
| Stainless steel washer | Superior Washer | 81610 |
| 24-well plate | VWR | 353047 |
Referencias
- Rockwood, D., Preda, R. C., Yucel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials Fabrication from Bombyx mori Silk Fibroin. Nature protocols. , (2011).
- Lawrence, B., Omenetto, F., Chui, K., Kaplan, D. Processing methods to control silk fibroin film biomaterial features. Journal of materials science. 43, 6967-6985 (2008).
- Altman, G., Diaz, F., Jakuba, C., Calabro, T., Horan, R., Chen, J. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24, 401-416 (2003).
- Hofmann, S., Wong, P. o., Foo, C., Rossetti, F., Textor, M., Vunjak-Novakovic, G., Kaplan, D. Silk fibroin as an organic polymer for controlled drug delivery. Journal of Controlled Release. 111, 219-227 (2006).
- Demura, M., Asakura, T. Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor. Biotechnology and bioengineering. 33, 598-603 (1989).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Lawrence, B., Cronin-Golomb, M., Georgakoudi, I., Kaplan, D., Omenetto, F. Bioactive silk protein biomaterial systems for optical devices. Biomacromolecules. 9, 1214-1220 (2008).
- Meinel, L., Hofmann, S., Karageorgiou, V., Kirker-Head, C., McCool, J., Gronowicz, G. The inflammatory responses to silk films in vitro and in vivo. Biomaterials. 26, 147-155 (2005).
- Vepari, C., Kaplan, D. Silk as a biomaterial. Progress in Polymer Science. 32, 8-9 (2007).
- Li, M., Ogiso, M., Minoura, N. Enzymatic degradation behavior of porous silk fibroin sheets. Biomaterials. 24, 357-365 (2003).
- Arai, T., Freddi, G., Innocenti, R., Tsukada, M. Biodegradation of Bombyx mori silk fibroin fibers and films. Journal of Applied Polymer Science. 91, 2383-2390 (2004).
- Lawrence, B., Marchant, J., Pindrus, M., Omenetto, F., Kaplan, D. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
- Ma, X., Cao, C., Zhu, H. The biocompatibility of silk fibroin films containing sulfonated silk fibroin. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 78, 89-96 (2006).
- Patel, A., Thakar, R., Chown, M., Ayala, P. Biophysical mechanisms of single-cell interactions with microtopographical cues. Biomedical. , (2010).
- Jin, H., Park, J., Karageorgiou, V., Kim, U., Valluzzi, R., Cebe, P. Water-Stable Silk Films with Reduced β-Sheet Content. Advanced Functional Materials. 15, 1241-1247 (2005).
- Lawrence, B., Wharram, S., Kluge, J., Leisk, G., Omenetto, F., Rosenblatt, M. Effect of Hydration on Silk Film Material Properties. Macromolecular Bioscience. 10, 393-403 (2010).
- Zhang, Y. Natural silk fibroin as a support for enzyme immobilization. Biotechnology Advances. 16, 961-971 (1998).
- Cebe, P., Kaplan, D. Mechanism of enzymatic degradation of beta-sheet crystals. Biomaterials. , (2010).
- Shaw, J. Fractionation of the fibroin of Bombyx mori with trypsin. Biochemical Journal. 93, 45 (1964).
- Rice, W., Firdous, S., Gupta, S., Hunter, M., Foo, C., Wang, Y. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
- Chirila, T., Barnard, Z., Harkin, D., Schwab, I., Hirst, L. Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders. Tissue Engineering Part A. 14, 1203-1211 (2008).
- Hu, X., Shmelev, K., Sun, L., Gil, E. -. S., Park, S. -. H., Cebe, P. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
- Omenetto, F., Kaplan, D. A new route for silk. Nature Photonics. 2, 641-643 (2008).
- Bray, L. J., George, K. A., Ainscough, S. L., Hutmacher, D. W., Chirila, T. V., Harkin, D. G. Human corneal epithelial equivalents constructed on Bombyx mori silk fibroin membranes. Biomaterials. 32, 5086-5091 (2011).
- Wang, N., Tytell, J. D., Ingber, D. E. Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 75-82 (2009).
- Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
