분리 및 Neurosphere 분석을 사용하여 인간 Glioblastoma의 Multiforme 종양 세포의 확장

1. 기본 GBM 조직의 수집 glioblastoma mutliforme (GBM) 종양은 암 진단과 수술을받은 환자로부터 얻은 것입니다. 준비는 신경 외과 팀하셔야합니다. 신경 외과는 신경 줄기 세포 (NSC) 10-15%의 항생제 (Peniciline / Streptomycine)와 보충 기저 매체를 포함하는 적절한 크기의 튜브에 resected의 GBM 종양 추가됩니다. 차가운 매체 실험실로 수술실에 제공해야합니다. 또는 감기에 HEPES – 버퍼 최소 필수 배지 (앙) 또는 인산염은 항생제의 높은 농도와 염분 (PBS)는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다 버퍼. resected 종양 조직은 얼음에있는 실험실로 전달, 그리고 후드를 배치됩니다. 2. 단일 셀 서스펜션에 차 종양의 분해 원래 중간 / PBS를 초과은 팔콘 튜브에서 제거되고 샘플 5-10m로 2-3 번 씻어입니다PBS / NSC 기저 매체의 전 혈액과 이물질을 제거합니다. PBS / 매체가 제거되고 GBM 종양 조직은 배양 접시에 배치됩니다. 조직은 작은 조각으로 잘라 trypsinization 프로세스의 면적을 증가 작은 조각에 번호 10 메스 블레이드와 다진 있습니다. 닦지는 종양의 크기에 따라 1~3분 소요될 수 있습니다. 다진 조직은 사전 예열 % 0.05 37 ° C의 물을 욕조에 10-15분에 대한 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 – 5ml에 trypsinized 있습니다. 전자 피펫은 15ml 팔콘 튜브에 작은 종양의 조각과 트립신를 전송하는 데 사용됩니다. 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨은 잠복기 후 효소 트립신의 반응을 중지에 추가됩니다. 트립신의는 불활 성화를 여러 번 다운 서스펜션을 pipetting과에 의해 보장됩니다. 그런 다음 중지를위한 5 분 800rpm (110g)에 centrifuging에 의해 아래 pelleted 있습니다. 뜨는가 삭제되고 조직 조각은 무균 NSC 바의 1ml에 resuspended 아르샐 매체. 대단히 짧은 부드럽게 부드러운 하얀 단일 세포 현탁액을 얻을 때까지 (3-7 회) 위아래 pipetting 및하여 dissociated 수 있습니다. pipetting 단계의 수는 직접 다진 조직의 입자의 크기에 따라 달라집니다. 그것이 세포 죽음과 구체 형성의 감소가 발생 하듯이 장기와 활발한 기계적 분리는 피해야한다. 취소 dissociated 조각과 파편을 제거하려면, 기저 매체 10-15 ML은 튜브에 추가되고 세포 현탁액은 50ml 튜브로 40 마이크론 셀 스트레이너를 통해 필터링됩니다. 필터링 정지 5 분에 대한 800rpm (110g)에 centrifuged입니다. 뜨는는 나중에 삭제됩니다. Pelletted 전지는 다음 셀 카운트를위한 완벽한 NSC 매체의 1 2ml에 resuspended 있습니다. 3. 셀 카운트 및 도금 세포 현탁액의 10 μL은 1ml eppendorf 튜브에 0.04 % Trypan 블루 90 μL에 추가됩니다. 참고 : 다른 적절한 세포를 거치도록tions도 사용할 수 있습니다. 정지를 섞어 아래 피펫합니다. 세포 / trypan 파랑 혼합 10 μL은 세포 밀도를 계산하기 위해 hemocytometer로 전송됩니다. 세포의 0.2 % 헤파린 (2μg/ml)의 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF와 1μl/ml와 보충 완료 NSC 매체 (9시 1분 비율 NSC 기저 매체와 NSC 확산 보완의 혼합물)에 도금 아르 적절한 조직 문화 선박. 중간의 5, 20, 40 ML는 각각, T25, T80과 T175 flasks에 사용됩니다. 항생제는 오염의 기회를 감소 1:100의 농도에서 매체에 추가할 수 있습니다. 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2 배양기 세트에 배치됩니다. 4. Passaging와 GBM 파생 분야의 확장 : neurospheres 직경 150-200 μm의의 평균 크기에 도달하면 문화 subculture 준비가되었습니다. 각 플라스크의 내용은 적절한 크기의 살균 tiss에서 제거 및 위치UE 문화 튜브, 그리고 실온에서 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged. 뜨는이 제거되고 펠렛은 0.05 % 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다. 최적의 trypsinization을 달성하기 위해, 세포 현탁액은 37 ° C 2-3 분 물 목욕에 incubated입니다. 트립신 활동을 중지하려면 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨 세포 현탁액에 추가되고 세포 현탁액은 부드럽게 위아래로 pipetted하고 있습니다. 세포 현탁액은 5 분 800 RPM (110g)에 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포는 NSC 매체의 1 ML에 resuspended 있습니다. 앞에서 설명한대로 셀 개수가 수행됩니다. 세포는 성장 인자와 같은 이전 부분에 설명된 적절한 크기의 조직 문화 선박의 도금과 보충 완료 NSC 매체에 5×10 4 셀 / ML의 농도에 도금하고 있습니다. 습기에 ° C 37 incubated 때 보조 neurospheres는 70~10일에 형성5% CO 2 ified 인큐베이터. 5. 대표 결과 : GBM 종양 조직에서 수확한 단일 세포를 도금 후, 종양 줄기와 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식과 (비디오와 그림 1 참조) 3-4일에 몇 가지 세포로 구성된 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 이러한 클러스터의 성장에 따라, 그들은 150-200 마이크론 양식 (비디오 및 그림 2 참조)의 평균 직경 7~8일하여 수 있도록 좀 더 원형 모양, 적절한 단계 밝은 분야를 취득. 높은 배율에서 건강 분야는 일반적으로 자신의 주변에서 microspikes를 보여줍니다. 문화 개시는 문화의 binging에 비 dissociated 대단히 짧은 시간의 존재로 인해 진정한 분야로 착각해서는 안됩니다 이후 1~2일의 클러스터와 같은 큰 범위를 가졌어요. 기본 종양 영역의 문화에 파편의 양은 조직의 초기 소스에 따라 다릅니다 그리고 그것은 모든 주위의 뇌 조직을 포함할지 여부. 적절한 조직 준비 기법매체의 충분한 양의 효소와 기계적 분리, 그리고 샘플의 후속 필터를 포함하는 것은 문화에 덜 파편이 발생할 수 있습니다. 그림 1. 사일 도금 후에 기본 GBM의 구체 문화. 종양 줄기 같은 세포가 세포 분열 따위에 의해 번식하고 3~4일에서 세포의 작은 클러스터를 생성합니다. 원본 확대, 20x. 그림 2. 팔일 도금 후 항로 일 GBM의 영역 문화를. 원본 확대, 20x.