인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

1. MDCK 세포 배양 10% FBS, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 1 밀리미터 나트륨 pyruvate, 7.5 % 나트륨 중탄산염의 5 %와 RPMI1640 전체 매체의 20 ML의 T-75cm 2 플라스크에서 하룻밤 문화 5,000,000 MDCK 세포 37 ° C 배양기에서 솔루션과 0.001 % β-메르 캅 토 에탄올이 5.2 % CO 2 주입. 2. PR8 감염 및 BAL 유체 수집 도전 C57BL / 6 마​​우스 intranasally 한 콧구멍을 통해 30 μl의 총 볼륨의 멸균 PBS에서 PR8 바이러스 5000 PFU와. 바이러스없이 전용 ​​무균 PBS를 사용하여 모의 감염을 수행. 쥐를 0, 2, 4, 감염 후 7 일 안락사와 흉강 열고 그것을 폭로하기 위해 마우스의 모피를 통해기도에 1cm의 절개를 병렬을 했네요. 기도의 근위 부분에서 중간선 절개를합니다. PBS-1 % BSA 0.5 ML과 함께 호흡 관을 불어 넣다하고 학위를 기음L 유체. 사용 전까지는 BAL 유체는 -20 ° C의 냉장고에 저장할 수 있습니다. 3. LI-COR의 오디세이로 바이러스 감염과 바이러스성 매트릭스 단백질 (M2)의 검출 인프라 붉은 염료 복합 항체를 사용하여 바이러스 titers을 계량하기 위해 T-75cm 2 flasks 및 광학 평평한 바닥에 검정 접시에 그들을에서 MDCK 세포를 수확 96 – 음 (10,000 아니라 당 세포) 또는 384도 (물론 5,000 세포 ) 접시. 37 문화 하룻밤을위한 MDCK 세포 ° RPMI1640 완전한 매체 및 혈청이없는 DMEM 함유 BSA (0.2 %, 중량 / 부피), 페니실린 (100 U / ML), 스트렙토 마이신 (100 μg / ml) 쇼핑, 나트륨으로 두 번 씻어에서 C pyruvate (1 ㎜), 나트륨 중탄산염 용액 (7.5 % 중 5 %) 및 ​​β-메르 캅 토 에탄올 (0.001 %). BAL 액 (384 잘 접시 96 – 웰 플레이트 또는 10 μl 50 μl) 또는 동등 볼륨 각각 잘 알려진 titers (96 – 웰 플레이트 또는 384를위한 10 μl, 50 μl와 PR8 바이러스 MDCK 세포를 품다 – DMEM 매체의) 접시에 잘포함하는 L-1-tosylamido-2-페닐 케톤 chloromethyl은 (TPCK) 트립신을 (0.2 μg / ml) 쇼핑 – 처리. 감염의 1 H 따라, 100 μl (96 – 웰 플레이트) 또는 10 % 각각 잘으로 RPMI1640 전체 매체를 FBS 함유 20 μl (384 잘 플레이트)를 추가합니다. 감염의 또 다른 16 H 위해 culturing MDCK 세포를 계속, PBS-1 % BSA 용액 100 μl (96 – 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 – 웰 플레이트)으로 두 번 MDCK 세포를 씻어과 100 μl (96 – 웰과 해결 판) 또는 5 분 1 % paraformaldehyde 20 μl (384 잘 플레이트). 고정 후, 추가로 차단을위한 PBS-1 % BSA 100 μl (96 – 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 잘 판)과 30 분 동안 MDCK 세포를 품어. M2 단백질에 대한 일차 항체 : 1 개 H (1:1000, PBS-1% BSA에 희석)에 대한 MDCK 세포를 품어 차단 후. 각각, 50 희석 항체 잘, 20 μl 당 μl 당 잘 96 – 웰 또는 384 잘 접시에 사용하십시오. 100 μl (96 – 웰 플레이트에 세 번이나 MDCK 세포를 씻으) 또는 PBS-포함된 50 μl (96 – 웰 플레이트) 또는 20 μl (384 – 웰 플레이트) 염소 항 마우스 IRDye @ 800 이차 항체와 1 H 1 % BSA와 부화를 (20 μl (384 잘 판) 1:200 희석). PBS-포함된 1 % BSA를 100 μl로 세 번이나 MDCK 세포를 씻으십시오. 또는 384 잘 플레이트 읽기 – 96에 대한 LI-COR의 오디세이 적외선 스캐너의 독서 유리 플랫폼에서 스테인드 접시를 놓고 독자를 설정합니다. 빈 부정적인 제어 우물은 LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용하여 설정할 수 있습니다. LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용 플레이트 내에 전체 플레이트 또는 선택한 우물을 수량. 자동 모양 도구를 사용하여, 시험 중간에 잘 96의 대상 영역 (ROI)의 경계를 그려 – 또는 384 – 잘 접시. 투자 수익 (ROI)의 창조는 소프트웨어가 바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교할 수 있습니다. 전체 분석을위한 기준 값을 설정하려면, 배경 투자 수익 (ROI)를 사용합니다. 현 대 적 인에 대한 투자 수익 (ROI) 내에 오디세이 소프트웨어가 제공하는 두 개의 반대 크로스 머리카락 소개잘 건너 형광의 강도를 다시. 검출을위한 780 nm의 채널 및 LI-COR의 오디세이 적외선 스캐너의 기준 파장과 같은 680 nm의를 사용하는 접시를 검사합니다. '읽기'명령이 활성화되면 투자 수익 (ROI)의 균일한 간격으로 형광 농도가 측정되며 수집된 데이터는 통합 가리 킵니다. 표준 편차 배율은 투자 수익 결정에 포함되는 기준 이상의 신호의 레벨을 결정합니다. 배경 형광은 혼자가 제어 모의 – 감염된 또는 보조 항체로부터 계량되며 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용됩니다. 그것이 정의된 각각의 장소에 대한 그물 픽셀 볼륨을 나타내는 및 기능 크기의 독립적이기 때문에 계산을위한 '통합 강도'를 선택했다. 미지 시료의 바이러스 titers을 계산하는 알려진 바이러스 titers에서 표준 곡선을 사용합니다. 정확하게 바이러스 titers을 계산하는 긴 보간 곡선을 사용합니다. v를 계산표준 곡선과 시험 샘플의 농도를 비교하여 테스트 샘플에 iral titers. 4. 대표 결과 IR 염료 기반의 높은 처리량 바이러스 탐지 시스템의 표준화 PR8 바이러스는 MDCK 세포를 감염시킬 수 있으므로, 우리는이 분석을 개발하는 데 이러한 세포를 사용했습니다. 우리는 독감 바이러스 모체 단백질 (M2)에 대한 일차 항체를 사용하여 바이러스 titers를 측정했습니다. 다른 방법과는 달리, 우리는 거의 적외선 염료의 복합이다 이차 항체를 사용했습니다. 이 방법은 M2 단백질을 감지하는 동안 생성되는 형광 강도를 사용하여 간단하고 자동화된 PR8 바이러스 titer 결정을 제공합니다. 인플루엔자 바이러스 감염 후, M2 단백질은 번역 운반하고 세포 표면을 포함하여 숙주 세포에 축적됩니다. 따라서, M2 단백질의 수량은 바이러스의 수량을 결정하는 측정 가능한 매개 변수를 나타냅니다. 에서 농도를 비교표준 곡선과 테스트 샘플 바이러스 titers의 정확한 측정을 제공합니다. 형광 기반의 방법의 효능을 확인하려면, 우리는 교양 4 MDCK 세포 / 잘 챔버의 10 하룻밤 사이에 슬라이드. 알려진 titers의 PR8 바이러스성 주식이 다른 플라크 형성 단위 (PFU)와 우물을 복제하기 위해 추가 한 시간 동안 세포에 adsorb로 허용되었다. 세포는 바이러스가 증식하도록 16 H 위해 incubated되었다. 이 후, 챔버 슬라이드에서 MDCK 세포는 AlexaFluor에 의해 추가로 한 H에 대한 488-복합 이차 항체를 따라, 1 H를 위해, 1 % paraformaldehyde로 고정 씻어 및 안티-M2 항체 물들일되었다. 감염된 MDCK 세포 공촛점 현미경 분석 자기편 단일층이 크게 손상되지했고 PR8 파생 M2 단백질은 감염된 MDCK 세포 (그림 1A) 내부에 다량 존재였다 보여주었다. Fluorescing 세포와 같은 낮은 바이러스성 titers과 감염에 포착할 수 10 2 </sup>. 이러한 분석은 또한 잘마다 MDCK 세포를 fluorescing의 수가 증가 PR8 바이러스 titers에 직접 비례했다고 밝혔다. , 아르곤 레이저 기반 fluorochrome 여기의 광 효율이 잡음 비율로 생생한 셀룰러 이미지, 좁은 신호를 제공하며 세포 autofluorescence 특히 낮은 titrations에서 극도로 어려운 바이러스 quantifications을 렌더링 있지만. 따라서 정확한 바이러스 추정 방법을 확립하기 위해 우리는 IR 염료 기반 감지 및 부량 시스템을 채용. MDCK 세포 (10 4 / 잘) PR8과 바이러스성 단백질에 감염된 96 – 웰 플레이트에서 배양해 줄 것은 안티 M2 IR 염료 복합 이차 항체 다음을 사용하여 발견되었다. 안티 M2 항체의 사용은 우리가 바이러스 수량의 직접적인 메트 릭으로 항원에 특정한 형광 강도를 사용하도록 허용했다. 형광 강도를 열거하기 위해 우리는 LI-COR 오디세이 기반 적외선 스캐너를 사용했습니다. 이 시스템은 두 채널 레이저 BAS를 사용에드 적외선 탐지가 fluorophores을 파악하고 배경 잡음에서 그들을 구별합니다. 첫 번째 채널은 680 nm의에서 흥분과 배경을 계량하기 위해 700 nm의에서 방출. 두 번째 채널은 780 nm의에서 fluorophores 그 자극을 감지 및 800 nm의에서 내보냅니다. LI-COR의 오디세이에 PR8에 감염된 MDCK 세포 검사는 바이러스 titer 종속 밝은 형광 (그림 1B)를 지적했다. M2 긍정적인 형광 MDCK 세포가 우물 (그림 1B) 안에서 선명하게 보이고 있었다. 10 2 -10 5 PFU부터 바이러스 titer에 대한 형광 강도의 긍정적인 상관 관계가 지속적으로 관측할 수 있었을 것이다. 분석의 감도에 대한 상한을 설정하는 세포 죽음에 대해 10 6 PFU의 리드보다 PR8 바이러스성 titrations 높다. 10 2 -10 3 PFU PR8 바이러스성 titers는 거의 적외선 염료의 높은 감도를 보여주지만, 최소한의 감지 양성 지속적으로 본. 신호 대 잡음 비율을 moc을 비교하여 결정되었다K-감염이나 isotype 항체 – 대우 MDCK 세포. 이러한 컨트롤 둘 다 형광 무시할 또는 감지 레벨 (그림 1B) 결과. 추가 감도를 향상시키고 테스트 샘플 볼륨 요구 사항을 줄이기 위해, 우리는 5 감염 × 10 3 MDCK 세포를 / 잘 384 잘 접시에. PR8의 다른 PFUs는 일련의 로그를 dilutions (그림 1C)로 테스트했습니다. 384도 접시에서 감지 민감도는 96 – 웰 플레이트 assays의 비교했습니다. 10 1과 10 두 2 PFU는 96 – 웰 플레이트에 비해 384 잘 접시에 일관되게 잘 나왔어. 96에서 형광 강도를 사용하여 – 또는 384 – 잘 플레이트 형식을, 우리는 표준 적정 곡선 (그림 1D) 구축. 두 번째 변수는 형광 강도가있는 동안이 계산에서 첫 번째 변수는 바이러스 titer입니다. 따라서 커브-맞게 determ 위해를 생성하는 지수 분포를 사용바이러스 titers와 형광 농도 사이의 다항식 관계를 오프라인. 우리는 또한 PR8 바이러스의 핵 단백질 (NP) (데이터가 표시되지 않음)에 대해 감독하는 다른 항체를 사용하여 우리의 관찰을 검증했습니다. PR8 변종의 독특한 소스도 방지 NP 또는 방지 M2 항체 (데이터가 표시되지 않음)에서 테스트되었습니다 MDCK 세포를 감염하는 데 사용되었다. 집단적으로, 우리는 IR 염료 기반의 단백질 검출 시스템은 바이러스 변종에 감염 진단하고 정확하게 감염 병원체의 titer를 열거할 수 있습니다 결론. 바이러스 titers을 계산하는 수학 고려 사항 아래 설명에 따라 형광 강도 및 titer의 결정의 수학적 계산이 완료됩니다. 염색법 절차에 따라 전체 강판 또는 강판 이내 선택한 우물은 LI-COR의 오디세이 소프트웨어를 사용하여 계량하고 있습니다. 자동 모양 도구 사용하여 대상 영역 (ROI)의 경계는 96의 테스트 우물 중간에 그려진되었다 – 또는 384 – 우리접시됩니다 (그림 2A와 B). 투자 수익 (ROI)의 창조는 소프트웨어가 바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교할 수 있습니다. 배경 투자 수익 (ROI)은 전체 분석을위한 기준 값을 설정하는 데 사용되었다. 두 개의 반대 십자선 (흰색)이 잘 (그림 2C)을 통해 형광의 강도를 측정하기위한 투자 수익 (ROI) 내에 도입되었습니다. 오른쪽과 그림 2C에서 대리인 우물 아래 곡선이 십자선을 따라 픽셀의 강도를 나타냅니다. 투자 수익 (ROI)의 균일한 간격으로 형광 농도가 측정되었으며 수집된 데이터 포인트가 통합되었다. 표준 편차 배율은 투자 수익 결정에 처음 포함되었습니다 기준 이상의 신호의 레벨을 결정. 배경 형광은 모의 – 감염된 또는 보조 혼자 항체 컨트롤에서 계량 및 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용되었다. 그것이 repres 때문에 계산을 위해 통합 강도를 선택정의된 각각의 장소 및 엔트 그물 픽셀 볼륨 기능 크기의 독립적입니다. 또한, 통합 강도는 해상도 실질적으로 독립적입니다. 총 강도 / 픽셀 (I)에서 발생하는 신호 강도에 해당하는 픽셀 영역 (가) 플러스 픽셀 영역 (B)의 배경에서 발생하는 신호에 잘 선택했습니다. 따라서 픽셀을위한 'i'를 : 나는 I = I의 I + B 전 픽셀 볼륨 신호의 크기와 그것이 분산되는 영역을 모두 나타냅니다. 신호 영역은 신호를 생성 시료의 분포와 관련되어 있습니다. 픽셀 볼륨 픽셀의 영역에서 'i'를 (가) 배 높이 (I) 픽셀 단위로 측정 전체 신호와 동일합니다. 따라서 픽셀을위한 'i'를 : 바이올렛 = 나는 그 총 픽셀 볼륨 따라서 전체 영역에서 총 신호의 요약입니다 : ; N N V = Σv 전 = aΣI 전 전 = 1 전 = 1 통합 적극성이 원형 / 사각형 (카운트 mm 2) 지역 곱한 기능에 둘러싸인 모든 픽셀의 강도 값의 합계입니다. 따라서, 통합 강도 = (ΣI I – 나) 여기서 B는 평균 배경 픽셀의 강도를 의미합니다. 이 수식은 제어 또는 실험 우물의 통합 신호 농도를 계산하고이를 표준 곡선을 설정합니다. 테스트 샘플에 바이러스성 titers이 표준 곡선을 사용하여 계산되었다. 농도 (강도) 정의의 투자​​ 수익 (ROI)에 형광 현재의 수량을 말합니다. 테스트 샘플의 농도는 calcula 있습니다같은 이미지에 기준 정의된 농도에 테드의 상대. 정확한 바이러스 titers를 계산하려면 각 농도 표준의 강도는 꾸몄다과 긴 보간 곡선과 함께 장착되어있다. 테스트 샘플의 농도는 표준 곡선 내에서 영역의 강도를 비교하여 계산됩니다. 인플루엔자에 감염된 생쥐의 BAL 액에서 바이러스 titers의 결정 임상 및 실험실 표본의 라이브 인플루엔자 바이러스 입자의 검출은 중요한 의미가있다. 따라서 우리가 다음 우리가 실험실 샘플에 바이러스 titers을 결정하기 위해이 방법을 활용할 수 있는지 여부를 조사했다. BAL 유체가 아닌 예방 접종을 생쥐에서 수집하여 PR8 바이러스의 알려진 액수를 타서되었다. 아군 BAL 유체는 선형적으로 바이러스 titers을 열거 위해 titrated했다. 아군 BAL 유체의 Aliquots은 96 – 웰 플레이트에 MDCK 세포를 감염하는 데 사용되는 고정 및 안티-M2 및 IR 염료 복합 secondar 물들일되었습니다Y의 항체. 그림 3A에 나타난 결과는 아군 BAL 액에서 바이러스 titers가 감지되었으며 표준 곡선 PR8 titers와 상호 것을 보여줍니다. 표준 곡선을 이용하여 마약 및 titrated BAL 유체의 정확한 바이러스성 번호는 계량되었다. 지수 곡선 적합 계산은 아군 BAL 유체 (그림 3B)의 바이러스 titers을 계산하는 척도를 제공했습니다. 이 방법을 통해 우리는이 접근 방식 (그림 3C)을 확인, 계산 및 마약 바이러스성 titers 사이 우수한 상관 관계를 획득하였습니다. 다음, 우리는 PR8에 감염된 생쥐에서 BAL 액을 분석했다. PR8는 광범위한 인간의 병리 및 안티 바이러스 면역 3 이해하기 murine 모델에 사용되었습니다. 생쥐의 그룹 intranasally PR8 5,000 PFU에 감염되었다. 마우스는 체중 감소, hunched 뒤쪽의 모습 뻗치고 모피 및 기타 임상 증상에 대한 감시했다. 일 0, 2, 4, 7 및 사후 감염의 10 일,생쥐가 희생되었고 BAL 체액을 채취했다. 이러한 실험실 표본으로 이용하기 위해서 MDCK 세포는 96 – 웰 플레이트에서 17 H 50 μl의 최종 볼륨에서 BAL 액의 시리얼 dilutions와 incubated했다. 주식 PR8 바이러스의 알려진 titers에 감염된 MDCK 세포의 제어 우물은 표준 곡선을 생성 하였다. 감염 후 세포는 씻어 고정하고 가까운 적외선 염료 복합 이차 항체 다음에 안티 – M2 일차 항체 물들일되었다. 모의 – 감염 또는 감염이 titer 계산을위한 배경 형광의 강도를 제공한 후 isotype 컨트롤로 치료했다 MDCK 세포. BAL 액의 분석은 실험실 표본의 PR8 바이러스 IR 염료 기반의 분석 시스템을 통해 감지되어 있는지 보여주었다. BAL 유체의 바이러스 부하의 상당한 증가 일 2 및 4 포스트 감염 (그림 4A)에서 관찰되었다. 통합 강도의 계산 일 2와 4에서 BAL 체액 내가을 게시한다는 지적nfection은 PR8 바이러스의 상당 수준 (그림 4B)가 포함되어 있습니다. 우리의 결과는이 질병의 심각도를 보여주 PR​​8 감염의 초기 단계에서 점진적이지만 상당한 체중 감량을 보여줍니다. 그럼에도 불구하고, 대부분의 마우스는 7 일 게시물 감염 (그림 4C)을 질병의 증상에서 회복과 체중을 얻는 시작했다. 10 일째 게시물 감염에서 마우스는 또한 체중 증가와 질병의 증상에 상당한 감소와 상호 바이러스의 등급을 나타내는 어떠한 감지 PR8이 부족해. 더욱 이러한 분석의 응용 프로그램을 확장하기 위해, 우리는 (H1N1) 인체 독감은 IR 염료 기반 항체 검출 시스템 분리 및 실시간 PCR 분석으로 비교 2009 테스트했습니다. 이 임상 샘플 의심되는 환자로부터 얻은 통합 nasopharyngeal / 인후 면봉으로부터 격리되었다. 격리는 밀워키 보건국 실험실에서 MDCK 세포주에 전파되었다. 테스트 결과는 안돼요 있었다실시간 PCR의 assays (그림 5)에 IR 염료 기반 방법의 감도를 확인할 빨강. 결과는 IR 염료 기반 항체 검출 시스템은 임상 관련 내에 PCR 기반의 분석 (10 TCID 50 / ML)과 가을과 비교 10 3 TCID 50 / ML로 낮은 바이러스 부하를 감지하는 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다 대부분의 환자 샘플 다양합니다. 이러한 결과는 IR 염료 기반의 분석 시스템은 충분한 감도, 연구 실험실과 임상 설정에서 바이러스 titer 열거 신청을받을 가능성이있다는 강력한 증거를 제공합니다. 1 그림. 인플루엔자 바이러스의 IR은 염료 기반의 면역 감지. () 8 – 잘 챔버 슬라이드에서 인플루엔자에 감염된 MDCK 세포의 공촛점 현미경 분석합니다. Immunofluorescence 미세한 분석은 자기편 MDCK 단일층는 바이러스 파생 M과 크게 온전하고로드 입증이 단백질. IR 염료와 LI-COR의 오디세이 시스템을 바탕으로 바이러스 titers의 (BC) 부량. 표준 곡선 및 지수 곡선 맞춤 프로파일 (D) 세대. 광고에서 제시된 데이터 다섯 독립적인 실험의 대표입니다. 그림 2. IR 염료를 사용하여 바이러스 titers를 결정 방법론. () 통합 형광 강도 측정. 시험 우물 (ROI) 내부에 정의된 영역이 형광 강도를 측정하는 편이 었지. 자동 모양 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 경계는 96의 테스트 우물 중간에 그려져 있었다 – 또는 접시 384도. 형광은 투자 수익 (ROI) 이내 개별 픽셀 (화소 = N)로 측정되었다. 통합 적극성이 원형 / 사각형 (카운트 mm 2) 지역 곱한 기능에 둘러싸인 모든 픽셀의 강도 값의 합계입니다. (B) 분석 우물의 통합 형광 농도를 결정. 투자 수익 (ROI)의 창조바이러스 titrated 샘플에 정의된 배경 우물을 비교하기 위해 LI-COR 스캐너를 허용했다. 배경 형광은 모의 – 감염된 또는 보조 혼자 항체 컨트롤에서 계량 및 테스트 우물의 통합 강도를 추정하는 데 사용되었다. 투자 수익 (ROI) 내의 데이터 포인트의 (C) 컬렉션. 두 개의 반대 십자선 (흰색)이 잘 건너 형광의 강도를 측정하기위한 투자 수익 (ROI) 내에 도입되었습니다. 오른쪽과 대표 우물 아래 곡선이 십자선을 따라 픽셀의 강도를 나타냅니다. 그림 3. PR8 아군 BAL 체액에있는 바이러스 titers의 감지 및 부량. () MDCK 세포가 하룻밤 사이에 96 – 웰 플레이트에서 배양해 및 PR8 아군 BAL 액과 함께 추가되었습니다. 플레이트는 LI-COR의 오디세이 시스템에서 읽을 수 있었다. (B) Exogenously 아군 BAL 액은 표준 곡선과 비교되었다. 계산에 예상 비르의 (C) 비교 야외 titers. 지수 곡선 피팅은 Y = 9.4784e 0.0014x를 제공했습니다. 교류에 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표입니다. 4 그림. PR8 감염된 생쥐에서 BAL 체액의 인플루엔자 바이러스의 검색 및 부량. () 생쥐의 그룹은 intranasally PR8 5,000 PFU에 감염되었다. MDCK 세포는 96 – 웰 플레이트 17 H 50 μl의 최종 볼륨에서 BAL 액의 시리얼 dilutions와 incubated했다. 감염 후 세포는 씻어 고정 및 IR 염료 복합 이차 항체 이어 안티 M2 일차 항체 물들일되었다. 가장 오른쪽 패널은 표준 곡선을 나타냅니다. (B)에 감염된 생쥐의 BAL 액에서 바이러스 titers의 부량. PR8 감염 동안 생쥐의 (C) 체중 감소는 바이러스 부하와 상호. 교류에 표시된 데이터는 세 독립적인 실험의 대표입니다. 다시 5 "SRC ="/ files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> 그림 5. 2009 감지 및 부량는 (H1N1) 유행 (PDM) 독감은 인간의 환자에서 분리. 감염된 MDCK 세포주의 절반 배 적정위한 () IR 염료 기반 항체 형광 시스템의 탐지. 형광 결과 분석 10 3 TCID 50 / ML과 같은 낮은 바이러스 부하를 감지하는 잠재력이있다 나타냅니다. (B)의 문화에서 추출한 핵산은 CDC 실시간 PCR 분석 12로 분석되었다 분리 알려진 titered H1N1의 직렬 10 배로 dilutions와 함께 격리. 실시간 PCR을위한 감지 한계는 10 TCID 50 / ML했습니다.