Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em> Ex vivo</em> RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino
Summary
Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican la<em> Ex vivo</emElectroporación> de plásmidos co-expresión de inhibitoria ARN (RNAi), y las buenas prácticas agrarias en la corteza de embriones de ratón. Este protocolo se presta al estudio de diversos aspectos de neurodesarrollo, tales como la neurogénesis, la migración neuronal y la morfogénesis neuronal incluida la dendrita y axón.
Abstract
La corteza cerebral dirige las funciones cognitivas superiores. Esta estructura seis capas se genera en el interior de un primer, fuera-última forma, en el que las neuronas primeros nacidos permanecen más cerca al ventrículo, mientras que las neuronas últimos nacidos migran más allá de las neuronas primeros nacidos hacia la superficie del cerebro 1. Además de la migración neuronal 2, un proceso clave para la función cortical normal es la regulación de la morfogénesis neuronal 3. Si bien la morfogénesis neuronal puede ser estudiado in vitro en cultivos primarios, hay mucho que aprender de cómo estos procesos están regulados en los entornos de tejidos.
Se describen las técnicas para analizar la migración neuronal y / o la morfogénesis en rodajas organotípicos de la corteza cerebral 4,6. Un vector pSilencer modificado se usa que contiene tanto un promotor U6 que impulsa el ARN de doble hebra de horquilla y un casete de expresión independiente que codifica la proteína GFP impulsado bya promotor CMV 7-9. Nuestro enfoque permite la evaluación rápida de los defectos en el crecimiento de las neuritas en caída específica de genes candidatos y ha sido utilizado con éxito en una pantalla para que los reguladores de crecimiento de las neuritas 8. Debido a que sólo un subconjunto de células se expresan las construcciones RNAi, las rebanadas organotípicos permitir un análisis del mosaico de los fenotipos posibles. Además, debido a este análisis se realiza en una aproximación cercana del entorno de vivo, que proporciona un bajo coste y rápida alternativa para la generación de animales transgénicos o knockout para los genes de función desconocida cortical. Finalmente, en comparación con la tecnología de electroporación in vivo, el éxito de los ex experimentos in vivo electroporación no depende de desarrollo proficiente habilidad cirugía y se puede realizar con un tiempo de formación más cortos y habilidad.
Protocol
Discussion
Estos métodos implican la electroporación ex vivo de los plásmidos que codifican ARN bicatenario horquillas 8 y la cultura de rebanadas organotípicos 4 proporcionan varias ventajas distintas. En primer lugar, estos métodos permiten una evaluación rápida de RNAi derivados de fenotipos. La inclusión de una expresión que codifica GFP cassette en el vector pSilencer mismo que contiene el promotor U6 que impulsa la doble cadena de ARN horquilla permite una rápida identificación y car…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Dra. Shirin Bonni para proporcionar la construcción pSil-GFP, el Dr. Alper Uzun para la ilustración de la Figura 1, y la instalación de Bioimagen Leduc para la microscopía confocal. EMM es apoyado por el premio a la Trayectoria para la ciencia médica con cargo al Fondo Burroughs Wellcome, un premio NARSAD de Jóvenes Investigadores, y el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01. SBL es apoyado por el NIH CNRR COBRE RR018728 P20-01, y ha recibido el apoyo de PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Referencias
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