交付使用表皮生长因子在人胰腺癌细胞转染基因受体有针对性的明胶基于工程Nanovectors

1。质粒DNA封装的表皮生长因子受体有针对性的明胶纳米粒子的制备硫醇盐明胶的合成以前的方法2-5 2 iminothiolane B型明胶的主要氨基酸残基共价共轭，硫醇盐明胶合成。阿胶1克溶解于100毫升的去离子水，并与20毫克2 iminothiolane盐酸在室温下15小时孵育。 对5毫米的盐酸溶液由1毫米的盐酸，每次3小时的解决方案，通过透析去除未反应的试剂。纯化硫醇盐明胶冻干和储存在4 ° C，为进一步利用。 DNA含有纳米粒子的制备 200毫克硫醇盐明胶溶解在水和溶液的pH值调整至7另外的0.2 M NaOH溶液。 1毫克的DNA和明胶溶液，轻轻混合。 冰鲜乙醇缓慢加入到混合物，而在高速搅拌的解决方案。纳米粒子形成溶剂组成改变时至75％的水酒精溶液。 进一步交联纳米粒子缓慢加入0.1毫升的8％（V / V）乙二醛解决方案。淬火未反应的试剂0.5毫升0.2 M甘氨酸溶液。 纳米粒子超离心30分钟16000转。沉淀用去离子水洗涤两次，纯化纳米粒子的冷冻干燥和保存在4 ° C。 纳米粒子的表面改性纳米粒子悬浮在浓度为10毫克/毫升0.1 M磷酸缓冲液（pH值7.4），孵育和2倍的甲氧基聚乙二醇琥珀羧甲基酯（MPEG – SCM，2000兆瓦DA）或马来酰亚胺 – 聚乙二醇琥珀羧基重量甲酯（MAL – PEG – SCM，2000兆瓦大）在室温慢速搅拌2小时。 聚乙二醇纳米粒子在30分钟16000转超离心收集第沉淀用去离子水洗涤两次，纯化纳米粒子的冷冻干燥和保存在4 ° C。 MAL – PEG – SCM改性纳米粒子悬浮在0.1M磷酸盐缓冲液（pH 6.5）的浓度为10mg/ml和培养与EGFR特异性多肽（YHWYGYTPQNVI GGGGC）在室温慢速搅拌6小时10％的重量。 多肽修饰纳米粒子的收集与超离心30分钟16000转。沉淀用去离子水洗涤两次，纯化纳米粒子的冷冻干燥和保存在4 ° C。 2。表皮生长因子受体针对性的纳米粒子的表征粒径和Zeta电位测量纳米粒子悬浮在水浓度为1mg/ml。暂停使用纳米激光粒度仪（马尔文公司）进行了分析。粒度分析在散射角为90度25 °C. Zeta电位在默认参数的介电常数，折射率和水的粘度在25 ° C。 扫描电子显微镜冻干纳米粒子被安装在铝样品装载和钯，以提高导电性，并尽量减少建设收费溅射涂层。根据日立4800场发射扫描电子显微镜在3千伏排放样品表面形貌观察。 化学分析电子能谱仪（ESCA） 冻干控制配方，聚乙二醇化和肽修饰纳米粒子由ESCA分析。它是在国家ESCA表面生物医学问题的分析中心（NESAC /生物），华盛顿大学（西雅图）。 样品放置在超高真空和暴露于低能量X射线束，从而诱发从表面中学光电子发射。 通过绘制检测到的电子数量作为一个功能斌丁能源，观测到的谱峰被分配到每个化学成分。 高分辨率C1s的光谱进行分析，以确定碳氢化合物的确切化学成分（CC或CH 285mV），286.4mV（CO）醚），羰基（C = O的288.1 mV的），每个功能的相对组成由曲线下面积。 封装质粒的稳定性封装的质粒DNA的稳定运行预制凝胶上提取的DNA证实。纳米粒子与0.2毫克/毫升含PBS在37 ° C（30分）和0.2 U / ml的DNA酶（在室温下10分钟）分别蛋白酶消化，同时或顺序。 100ng/well在每孔18μL体积浓度在1.2％琼脂糖凝胶（GP）（E -凝胶，Invitrogen公司，CA）样品，然后装上。裸质粒加载控制和凝胶75 V 30分钟运行。柯达数字化X射线标本（DXS）系统是用于可视化bANDS与紫外线transluminescence。 质粒加载的测定质粒封装的纳米粒子悬浮在为1mg/ml，0.2mg/ml蛋白酶消化在37 ° C 30分钟。的解决办法是13,000转离心10分钟，收集上清和Picogreen法（Invitrogen公司）的质粒浓度测试。封装的比例计算除以初始装载0.5％（W / W）封装的质粒浓度。 3， 在 PANC – 1胰腺癌细胞的体外转染研究细胞培养条件 PANC – 1和CAPAN – 1胰腺腺癌细胞系SKOV3卵巢腺癌细胞和NIH – 3T3小鼠成纤维细胞株获得自ATCC。 PANC – 1和NIH – 3T3生长的DMEM供应L -谷氨酰胺，笔链球菌和10％胎牛血清的37 ° C和5％CO 2，而CAPAN – 1所需的DMEM提供20％胎牛血清。SKOV3的生长提供10％胎牛血清的RPMI – 1640。 西方EGFR表达的印迹分析从200万细胞细胞裂解液收集和总蛋白的浓度用BCA法测定（皮尔斯）分析。 NIH – 3T3被用来作为阴性对照和SKOV3用于EGFR表达阳性对照。 10微克总蛋白提取物在135V运行90分钟的预制钠十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS – PAGE）系统。 随后，凝胶转移到PVDF膜iBlot干杂交系统（Invitrogen公司）。 在室温下1小时，5％的非脂肪牛奶中含有吐温Tris缓冲液（TBS – T）膜被堵塞。 膜被切断，并培养初级兔β-肌动蛋白抗体与1:1,000稀释1:1,000稀释的初级兔表皮生长因子受体抗体分别一夜之间在4 ° C。 膜，再用水洗两次TBS – T和培养与1:2000稀释的二级抗兔辣根过氧化物酶偶联IgG在TBS – T在室温下1小时。 用TBS – T和水冲洗多余的抗体后，加入4毫升的ECL底物（皮尔斯，罗克福德，IL，美国）和孵育膜5分钟。 化学发光带，然后可视化使用柯达数码X射线标本（DXS）系统。 与不同配方的细胞活力研究 PANC – 1细胞生长在96孔板，每孔10000细胞在补充DMEM培养液200μL过夜。 生长培养基更换为无血清媒体0含有不同浓度的纳米粒子，0.5，1，2，4，6毫克/毫升。 1mg/ml的爱德华王子岛，一个已知的细胞毒性阳离子聚合物，作为阳性对照。 细胞经6小时200μL纳米粒子，然后换成20μLMTS试剂和100μL完成文化传媒。 经过3个小时的潜伏期后在37 ° C，5％CO 2，甲臜产物的吸光度在490nm处测量，与百特SynergyHT酶标仪（Winooski VT），。 ％的细胞活力，表现为吸光度聚合物处理的细胞与阴性对照组（0mg/ml）乘以100的比例绘制聚合物浓度的功能。 细胞贩运研究罗丹明B异硫氰酸盐（RBITC）使用共轭硫醇盐明胶，通过与胺组反应。 RBITC透析和冷冻干燥后，标记的硫醇盐明胶用于制备纳米。 之前去溶剂，25μLPicoGreen与1mg的质粒1分钟混合和标记质粒分别加入明胶溶液。以前的方法不同的配方。 PANC – 1细胞生长在6孔板中含有200,000个单元格的玻璃盖，单p呃好。经过一夜的增长，标记纳米粒子2毫升共收治到每口井与1mg/ml的浓度在无血清培养。 不同时间点后，从15分钟至6小时，培养基取代含1μg/mlHoest 33342（Invitrogen公司）在室温孵育15分钟的中等文化。 4％多聚甲醛溶液2毫升更换成每口井，修复细胞。细胞，然后用PBS洗两次。 安装在玻片Coversilps。激光扫描共聚焦荧光显微镜是用来固定细胞的图像。 定性测定转染效率的pEGFP – N1封装荧光显微镜的纳米粒子以pEGFP – N1质粒分别封装成纳米颗粒和悬浮浓度相当于每毫升含10μg质粒，为进一步治疗的无血清媒体。 PANC – 1细胞在6孔板contai过夜宁20细胞，每孔玻璃盖单。 2毫升的pEGFP – N1质粒封装的纳米粒子被收治到每口井。质粒20μg20μL脂质体，阳离子脂质体转染试剂混合，它被用来作为阳性对照，而未经处理的细胞作为阴性对照。 细胞培养6小时不同的配方。 培养基更换培养基和细胞被转染后24，48，72和96小时。 后转染后，含有Hoest 33342（Invitrogen公司）1μg/ml语言与文化，并更换培养基培养细胞在室温下15分钟。 到载玻片和盖玻片分别安装荧光显微镜下观察GFP表达的细胞。微分干涉对比（DIC）和荧光图像的收购，使用奥林巴斯BX61显微镜和数字图像处理Image J软件。 <li>定量测定ELISA法检测转染效率的pEGFP – N1的封装与纳米粒子以pEGFP – N1质粒分别封装成纳米颗粒和悬浮浓度相当于每毫升含10μg质粒，为进一步治疗的无血清媒体。 PANC – 1细胞生长一夜之间在6孔板每孔20万细胞。 2毫升的pEGFP – N1质粒封装的纳米粒子被收治到每口井。质粒20μg混合20μL脂质体，阳离子脂质体转染试剂，这是作为阳性对照和未经处理的细胞作为阴性对照。 细胞培养6小时不同的配方。 培养基更换培养基和细胞后孵育24，48，72和96小时。 后转染后，细胞裂解液从每口井收集，分析总蛋白浓度用BCA法测定（皮尔斯）。 孔板是COA泰德与1:1000稀释的单克隆抗GFP抗体，每孔100μL。培养2小时后，板洗净，用PBS – 0.5％（W / V）吐温80的4倍。 每孔分别加入300μL的TBS阻止缓冲区和孵育2小时。然后板，然后用PBS – 0.5％（W / V）吐温80的4倍。 各组蛋白30μg加入板，并在4℃过夜孵育。然后板，然后用PBS – 0.5％（W / V）吐温80的4倍。 1:2400稀释的碱性磷酸酶的辅助抗GFP抗体100μL，每孔加入孵育1小时。然后板，然后用PBS – 0.5％（W / V）吐温80的4倍。 100μL碱性磷酸酶底物，每孔加入孵育30分钟到1小时。板测量与百特协同HT吸收酶标仪在405纳米。 表达GFP浓度为纳克每英里lligrams的总蛋白。 WT – P53质粒封装的纳米粒子通过RT – PCR定性检测转染效率 WT – P53质粒分别封装成纳米颗粒和悬浮在无血清媒体浓度相当于每毫升10μg质粒，为进一步治疗。 PANC – 1细胞生长一夜之间在6孔板每孔20万细胞。 WT – P53质粒封装纳米粒子2毫升共收治到每口井。质粒20μg混合20μL脂质体，阳离子脂质体转染试剂，这是作为阳性对照和未经处理的细胞作为阴性对照。 细胞培养6小时不同的配方。 培养基更换培养基和细胞后孵育48小时。 从每口井的mRNA提取，使用高纯度的RNA提取试剂盒（罗氏，印第安纳波利斯，IN），和与Nanodrop 2000测量（Thermo科学，Wilminton，DE）。 RT – PCR技术是通过使用QIAGEN公司一步法RT – PCR试剂盒（QIAGEN公司，瓦伦西亚，CA）。引物为p53，BCL – 2，Bax蛋白，β-肌动蛋白，DR5，APAF – 1，彪马，Survivin的合成欧陆MWG操纵子（汉茨维尔，AL）。 凝胶电泳PCR产物进行了评估和ImageJ软件分析的cDNA带的像素。 WT – P53治疗效率的定量测定palsmid封装的纳米粒子 WT – P53质粒封装成纳米粒子，在无血清媒体暂停浓度相当于每毫升含10μg质粒，为进一步治疗。 PANC – 1细胞生长一夜之间在6孔板每孔20万细胞。 WT – P53质粒封装纳米粒子2毫升共收治到每口井。质粒20μg20μL脂质体，阳离子脂质体转染试剂，这是作为阳性对照和未经处理的细胞混合作为阴性对照。 细胞培养6小时不同的配方。 培养基更换培养基和细胞后孵育24，48，72和96小时。 染色质凝聚/膜通透性/死细胞凋亡试剂盒（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）是用来标记细胞凋亡，坏死细胞和活细胞与不同的染料。 iCys研究从CompuCyte成像仪（韦斯特伍德，MA）被用来进行分析和比较，治疗后细胞凋亡水平。基于荧光显微图像，所有颜色的强度是记录和绘制与计数和计算不同人群的百分比。 阴性对照，这意味着没有治疗的细胞相比，细胞凋亡的褶皱变化计算出，并在图中列出的。 3.8.8 APO – ONE均质的caspase – 3 / 7检测试剂盒（Promega公司，麦迪逊，WI）是用于研究的PRO -凋亡活性后野生型p53转染质粒。 1mg/ml的裴被用来作为阴性对照，以消除所有的凋亡活性。经过转染后，罗丹明110细胞与治疗，二（N – CBZL -天冬氨酰- L -谷氨酰- L – valyl – L -天门冬酰胺;的Z – DEVD – R110），这是一个基板的caspase 3 / 7，长达18个小时。 百特协同HT荧光板读者五百二十〇分之四百九十纳米板测量。绿色荧光强度的基础上，促凋亡活性进行评估。 4。代表性的成果 1。表皮生长因子受体针对性的纳米粒子的合成和Chatacterization 作为该计划在图1表明，表皮生长因子受体靶向肽修饰的纳米粒子合成了。由脱溶剂制备的纳米粒子粒径和Zeta电位的特点。硫醇盐明胶制备的平均粒径和表面电荷的粒子表1列出了不同程度的硫醇。不同的纳米粒子的平均粒径是150-250纳米之间。硫醇盐纳米粒子具有更小的尺寸相比，明胶纳米粒子，可能是由于颗粒内的二硫键形成。不同的表面改性，纳米粒子的大小也随之增加。不同配方的Zeta电位-20毫伏左右。扫描电镜分析，观察的大小，表面形貌和纳米粒子的球形和相应的激光粒度仪的结果。明胶纳米粒子和硫醇盐明胶纳米粒子的DNA装载效率均高于95％（见表1）。 图1。化学反应计划，说明与表皮生长事实上硫醇盐明胶纳米粒子的表面改性R受体（EGFR）的结合肽通过聚乙二醇（PEG）的间隔。 表征纳米粒子 制定 纳米粒子的直径（NM） Zeta电位值（mV） 质粒DNA装载效率（％） 凝胶NP 151.4 ± 23.5 -17.1 ± 5.23 95.6 ± 2.2 SH – 凝胶NP 132.6 ± 17.9 -24.6 ± 5.16 97.0 ± 3.8 SH -凝胶PEG 179.0 ± 30.9 -22.3 ± 9.50 95.8 ± 6.5 SH – 凝胶PEG肽 230.8 ± 41.5 -18.1 ± 4.02 94.8 ± 5.1 打鼓表1控制和表皮生长因子受体有针对性的明胶和硫醇盐明胶纳米粒子的粒径，表面电荷，质粒DNA包封。 高分辨率的 C 1s扫描电子能谱化学分析（ESCA）是用来分析表面的硫醇盐明胶（SH凝胶NP），PEG修饰硫醇盐明胶（SH -凝胶PEG）和表皮生长因子受体的组成部分，针对肽修饰硫醇盐明胶纳米粒子（SH – 凝胶PEG肽）。表2结果表明，CH（碳氢化合物），CO（乙醚），和C = O（羰基）组峰强度为285.0，286.3，和288.1 eV的分别。醚CO信号增加PEG修饰后的肽共轭下降之后。虽然有所减少氮组成的PEG修饰后，后证实纳米粒子的存在表皮生长因子受体靶向肽肽修改，增加。 ESCA分析，进一步证实了PEG与多肽的表面改性。 颗粒表面化学成分分析的电子能谱 制定 的C 1s（％） 的O 1s（％） ñ 1S（％） SH – 凝胶NP 59.3 ± 0.8 22.9 ± 0.5 12.9 ± 0.1 SH -凝胶PEG 58.2 ± 0.6 28.0 ± 1.2 9.5 ± 0.7 SH – 凝胶PEG肽 56.7 ± 0.8 25.9 ± 0.7 12.3 ± 0.6 制定 CC（％） CO，N（％） C = O（％ ） SH – 凝胶NP 51.5 26.6 21.9 SH -凝胶PEG 17.1 63.1 19.8 SH – 凝胶PEG肽 33.1 42.8 24.1 表2，C 1S高分辨率扫描电子能谱化学分析（ESCA） 为了考察封装质粒的稳定性，纳米粒子治疗，与蛋白酶或DNA酶分别simuntaneously或顺序。电泳后，在图2的结果表明，封装在所有的纳米颗粒的质粒DNA是由纳米粒子和稳定，可比裸质粒DNA保护。这些研究表明，所有这些纳米颗粒可以封装和封装后保留的质粒结构。 / files/ftp_upload/3612/3612fig2.jpg“/> 图2。硫醇盐明胶包裹的质粒DNA的稳定性，PEG修饰硫醇盐明胶，和表皮生长因子受体肽修饰的琼脂糖凝胶电泳硫醇盐明胶纳米粒子。纳米粒子分别用0.2毫克/毫升的蛋白酶，证明质粒DNA在纳米粒子的矩阵封装 2。基线胰腺癌细胞的表皮生长因子受体表达两个人胰腺癌细胞株（PANC – 1和CAPAN – 1）EGFR表达的免疫印迹分析。人卵巢腺癌（SKOV3）和小鼠成纤维细胞（（NIH – 3T3）细胞被选中作为阳性和阴性对照，β-肌动蛋白是蛋白质负荷控制分析。PANC – 1细胞表现出更高的EGFR表达CAPAN – 1相比然后用此细胞株在体外研究中的下列 3。细胞毒性控制和SurfaCE改性的硫醇盐明胶纳米粒子为了评估纳米粒子的细胞相互作用，细胞毒性实验进行了纳米粒子治疗后。根据图3中的结果，在控制和表面改性的纳米粒子是相对安全和生物相容性PANC – 1细胞，即使在高浓度比较裴。 1mg/ml的纳米粒子进行了以下研究。 图3。百分比作为制定纳米粒子浓度PANC – 1细胞功能的细胞活力，四氮唑染料（MTS）检测评价 4。 PANC – 1细胞受体介导的细胞摄取为了确认表面的表皮生长因子受体靶向肽和受体介导的endocytotic纳米粒子吸收的辅助功能，系统设计的标签每个合作mponent用不同的荧光纳米粒子在细胞中的吸收和贩运的可视化。有了这个标签制度，质粒DNA，纳米粒子和细胞核可确定。使用激光扫描共聚焦荧光显微镜是从15分钟至6小时，采取不同时间点的图像。通过比较不同配方的图像，共轭肽明胶纳米粒子显示，在30分钟内快速吸收和质粒释放。这一结果进一步证明，表皮生长因子受体肽共轭纳米粒子经历与表皮生长因子受体的肽和表皮生长因子受体受体细胞表面上，这是快得多之间的快速互动，促进内吞作用，相比其他粒子，接受非特定的内吞作用。 细胞的运输研究 图4共聚焦荧光显微镜。alysis的PANC – 1细胞的DNA封装的纳米粒子吸收和贩运。 （红色=罗丹明标记的纳米粒子，绿色= PicoGreen的标记质粒DNA，和蓝色的DAPI标记细胞核）。激光功率少7倍，在降低面板的最后四个数字。 5。定性和定量体外转染增强型绿色荧光蛋白在图5和图6荧光显微镜分析，酶联免疫吸附被用来衡量在PANC – 1细胞后管理，经过修改，PEG修饰和表皮生​​长因子受体肽修饰硫醇盐明胶纳米粒子的定性和定量GFP转染效率。表皮生长因子受体针对性的纳米粒子交付质粒GFP表达的最高水平后48小时内，相对于其他控件，包括脂质体复合物的DNA。 图5 GFP的表达。用ELISA nalyzed绘制时间后管理控制和表皮生长因子受体针对性的纳米粒子的质粒DNA功能。 荧光显微分析GFP的转 图6。epifluoresence显微镜的PANC – 1细胞的绿色荧光蛋白表达与EGFP – N1 24，48，72和96小时后转染后的定性分析。脂质体- DNA复合物被用来作为阳性对照。 6。PANC – 1细胞在体外转染野生型p53质粒野生型p53质粒PORF – hp53 EF -1α/ HTLV病毒的混合子， 从大肠杆菌提取大肠杆菌和封装成纳米粒子研究细胞凋亡的治疗效果。 PANC – 1细胞治疗颗粒为6小时和另外24个后转，48，72和96小时。 由于P53能诱导细胞凋亡，为了完成这个功能，将涉及许多下游的转录因子直接由野生型p53的表达调节。其中，Bax和caspase – 3的，caspase – 9的，DR5，彪马和APAF – 1，受p53的表达，而Bcl – 2的，生存将下调。为了研究这些转录因子的水平，mRNA的提取PANC – 1细胞转染后48小时后进行RT – PCR。凝胶电泳的产品进行了评价和乐队与ImageJ分析。根据图7显示的结果，survivin的显着下降与表皮生长因子受体有针对性的其他治疗方法相比，硫醇盐明胶纳米粒子治疗，没有明显的变化是BCL – 2，Bax和caspase – 3表达，caspase – 9的，DR5，彪马和APAF 1increased针对性的纳米粒子治疗。 les/ftp_upload/3612/3612fig7.jpg“/> 图7。下游因素，WT – p53表达的mRNA水平，用RT – PCR相比，转染后48小时后。 野生型p53基因转染后，染色质凝聚/膜通透性/死细胞凋亡试剂盒是用来区分细胞凋亡，坏死细胞和活细胞与不同的染料。 iCys研究从CompuCyte成像仪（韦斯特伍德，MA）被用来进行分析和比较，治疗后细胞凋亡水平。阴性对照相比，细胞凋亡倍的变化，计算，并在图8中列出。表皮生长因子受体有针对性的硫醇盐明胶nanopaticles显示后转染后的最高的细胞凋亡的人口。的caspase 3 / 7活性的分析还表明，表皮生长因子受体针对性的纳米粒子迅速内化和PANC – 1细胞凋亡活性最高水平。 <img alt="图8" src="/files/ftp_upload/3612/3612fig8.jpg" /> 图8：在控制野生型p53的促凋亡活性的流式细胞仪分析转染PANC – 1细胞使用iCys °成像流式细胞仪