En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

1. Morfolino preparación: Todos los oligos morfolinos deben ser diseñados y ordenados a través de GeneTools (Philomath, OR). Utilizamos la carga positiva lisamina etiquetados morfolinos para conducir los morfolinos electroporated hacia el electrodo negativo. Hemos intentado, sin éxito, objetivo con carga negativa con fluoresceína etiquetados morfolinos para el electrodo positivo con esta técnica. Diluir 300 nmol de morfolino en 100 l de agua libre de nucleasa para obtener una solución 3 mM. Alícuota del morfolino en varios tubos de microcentrífuga sellada en parafina. Almacene lejos de la luz a temperatura ambiente. Determinar la concentración morfolino mediante la dilución de 5 l de morfolino (o agua para diluir el morfolinos como un espacio en blanco) en 95 l de HCl 0,1 N. La longitud de onda del espectrofotómetro (λ) a 265 nm. Calcular la constante de su morfolino mediante la siguiente ecuación: Constante = peso molecular en particular a su morfolino X 1000/molar absorbancia. Va a encontrar el peso molecular y los datos de absorbancia molar de la "Oligo Propiedades" que acompañan a cada hoja de morfolino. Analizar el espacio en blanco para verificar las lecturas de referencia y tomar las lecturas de cada diluida morfolino. Multiplicar la absorbancia a 265 nm de cada morfolino por su constante y determinada por el factor de dilución para obtener la concentración en ng / ul. Divida este número por el peso molecular para determinar la concentración en mM. Diluir el morfolino, si es necesario, a una concentración de trabajo. 2. Eliminar la capa de la córnea exterior: 6-12 meses anestesiar pez cebra adulto mayor en tricaína o 2-fenoxietanol a 1,0 mg / ml en el tanque de agua de pez cebra. Envuelva el pez cebra en un húmedo pedazo de toalla de papel, que cubre las branquias, pero dejando el ojo expuesto. El pescado envuelto se coloca bajo un estereoscopio y la ampliación se incrementa hasta que el diámetro del ojo se llena aproximadamente un tercio deel campo visual (Figura 1). Utilizando Dumont # 5 pinzas, agarre la córnea exterior cerca de la fisura óptica. Este tejido es de color rojo y está etiquetada como "OC" en la Figura 1. Hay una que sobresale del labio o de la flecha marcada "CL". Tirar a un ángulo bajo (es decir, 10 grados) a través del ojo para eliminar la córnea exterior. Con la práctica, esto se puede completar en un solo movimiento. Si la hoja de pinzas, volver a agarrar el pañuelo y tirar de nuevo en un ángulo bajo hasta que sea removido. Una córnea muy unido puede causar que el ojo se desprendió de la toma cuando se tira. Usted puede mantener los ojos se conviertan en desplazadas por estabilizarse con otro conjunto de pinzas. 3. Incisión en la córnea y la inyección de morfolino: Inmediatamente después de la eliminación de la córnea exterior, hacer una pequeña incisión en la córnea, donde el alumno cumple con los iris (Figura 2). Esto se hace usando un zafiro hoja de bisturí (ver Materiales). Carga 0,5 l de la solución 3.0 mM morfolino en un Hamilten jeringa equipada con un medidor de 33 extraíble, romo extremo de la aguja (ver Materiales). Pipeta de arriba y abajo para eliminar las burbujas de aire en la línea. Con cuidado, inserte la aguja en el humor vítreo a través de la incisión (Figura 2). No inserte la aguja demasiado lejos o que se perfore la retina o desplazar la lente. Inyecte lentamente la solución morfolino en el espacio vítreo. Dependiendo de la edad de los peces, el espacio vítreo celebrará ~ 0,5 l. Usted debe visualizar vítreo incoloro se escape de la incisión, ya que es desplazada por la solución morfolino. Inyectar hasta una pequeña cantidad de fugas de solución morfolino fuera de la incisión. Que claramente debe visualizar el lisamina etiquetados con morfolino dentro del ojo. Después de la inyección, el retorno a los peces en el tanque de recuperación. Por lo general, sólo se inyectan en el ojo izquierdo, con el ojo derecho como un control no inyectadas, pero la electroporación de los dos ojos es posible. 4. Electroporación: Siguientela inyección de aproximadamente 10 peces, volver a anestesiar a los peces una inyección y lo envuelve en un pedazo de toalla de papel humedecida, apenas cubriendo las branquias, pero dejando el ojo expuesto. La transferencia de los peces a una placa de Petri. Póngase guantes de látex o similares para evitar la exposición a la anestesia. Mientras que suavemente la celebración de los peces en el fondo del plato, llenar el recipiente con la anestesia (Figura 3, panel izquierdo). Un electrodo de platino de 3 mm de diámetro de la placa (ver Materiales) se localiza en los pulsos de electroporación de aproximadamente la mitad de la retina. Por lo general blanco de la retina dorsal. Presione suavemente el electrodo positivo a la baja en la mitad ventral del ojo. Con la córnea exterior removida, el ojo es fácil de girar, dejando al descubierto la parte dorsal del globo ocular. Mientras sigue presionando hacia abajo en la parte ventral del ojo, colocar el electrodo negativo cercano (~ 1 – 2 mm) de la media expuesta dorsal del ojo. Tenga cuidado de no tocar el electrodo negativo directamente a los ojos, lo que resultará en dañosla retina dorsal. Una vez que determine la distancia adecuada entre los electrodos, utilice el tornillo de ajuste en el mango de los electrodos para mantener que se propagan cuando electroporating. Esto evita que el electrodo negativo una distancia óptima del globo ocular cuando el electrodo positivo se presiona hacia abajo en su posición. Electroporar del ojo usando una Electroporador CUY21 de onda cuadrada (ver Materiales). Los parámetros de electroporación se debe establecer en dos períodos consecutivos de 50-ms pulsos, a los 75 V, con una pausa de 1 segundo entre los pulsos. Volver a los peces del tanque. Por lo general comienzan el protocolo para la constante de luz inducida por la degeneración de la retina inmediatamente después de la electroporación. 5. Los resultados representativos: Durante 3-5 días después de la electroporación (dependiendo de la estabilidad de la morfolino), la etiqueta lisamina se puede visualizar en todas las capas de la retina en la retina seccionado (Figura 4). Esto sirve como una confirmación de la presencia dela etiqueta morfolino. Podemos lograr caída proteína completa hasta 3-5 días después de la electroporación, dependiendo de la eficacia de la morpholino (Figura 5). Por lo general, durante los estudios de tratamiento con luz, cosechamos los ojos a las 3 o 4 días después de la electroporación morfolino. Esto se hace mediante la eliminación de todo el ojo con unas pinzas Dumont # 5B con extremos curvos (Figura 6; Materiales) y procesamiento de los tejidos por inmunohistoquímica 15. Al igual que con cualquier otra técnica de derribo, una demostración de caída eficiente debe ser demostrado con el fin de validar el fenotipo. Por lo tanto, se sugiere la obtención de antisueros para la proteína de interés. Alternativamente, si el anticuerpo no está disponible y el morfolino está dirigido a cualquiera de los aceptor de empalme o zona del donador en el pre-ARNm, se bloqueará el empalme eficiente de los ARNm. En este caso, es posible el uso de la transcriptasa inversa-PCR para amplificar las secuencias de acompañamiento en el ARN morphant y determinar la eficacia de bloquear el splic normalespatrón de ing. Cuando la retina se seccionan desde nasal a temporal en el eje ventral dorsal, las casillas sombreadas azul (Figura 6) representan las áreas de la retina que son a menudo dañados por el evento en sí electroporación. La caja de color rosa sombreada representa el área que se presentará la morfolino en células de la retina por la electroporación. Figura 1. Esquema que representa la eliminación de las capas epiteliales de la córnea. El panel izquierdo muestra las principales características estructurales del ojo, incluyendo la lente (L), el humor vítreo (Vit), la retina (R), la córnea exterior (CO), la córnea interna (IC), y la protrusión de la córnea ( CL). La orientación del ojo se muestra en la parte inferior derecha de la primera placa y la etiqueta es anterior (A), posterior (P), dorsal (D) y ventral (V). El color rojo indica la córnea externa que se retira. La segunda bandeja El demuestra cómo las pinzas se utilizan para captar la protrusión corneal y para tirar de la córnea exterior a través de los ojos en un ángulo bajo (tercer panel). El panel derecho muestra cómo un segundo par de pinzas se pueden utilizar para estabilizar el ojo mientras tira de la córnea. Figura 2. Esquema de los pasos involucrados en la inyección intravítrea de morfolino. Una pequeña incisión en el ojo donde el alumno cumple con los iris (panel izquierdo). La diferencia resultante debe ser lo suficientemente grande para una aguja de calibre 33, que se llena con la solución de morfolino, que se insertará (panel central). Inyecte lentamente 0,5 l de solución en el humor vítreo (panel derecho). Usted debe visualizar una pequeña cantidad de solución vítrea salir de la incisión en el humor vítreo está parcialmente sustituida por con-lisamina etiquetados morfolino (panel derecho). ig3.jpg "/> Figura 3. Esquema del procedimiento de electroporación en general. El pez anestesiado, que se inyecta por vía intravítrea con el morfolino, se envolvió en una toalla de papel húmeda (panel izquierdo). La toalla de papel debe cubrir las branquias, pero no obstruir la vista (panel central). Presione suavemente el electrodo positivo hacia abajo en la parte ventral del ojo, permitiendo que la mitad dorsal del ojo a girar fuera de la cuenca. Colocar el electrodo negativo de aproximadamente 1 mm de la media dorsal de los ojos y comenzar la electroporación (panel derecho). Figura 4. Imagen confocal comparar una retina electroporated intravítrea sin la inyección de un morfolino lisamina-etiquetados (A), y en la retina una inyección intravítrea y electroporación con el morfolino lisamina-etiquetados (B). La etiqueta lisamina se encuentra en todas las capas de la retina y los tipos de células. ROS, barra exteriorsegmentos, ONL, la capa nuclear externa, capa de INL, nuclear interna, GCL, capa de células ganglionares. Figura 5. Confocal de imágenes comparando inmunolocalización PCNA en las retinas de electroporación con un morfolino control (panel izquierdo) y las retinas de electroporación con un morfolino anti-PCNA (paneles de la derecha) antes de la luz de la muerte inducida por las células fotorreceptoras. Adaptada a la oscuridad pez cebra adultos albinos fueron colocados en una luz intensa constante por 1, 2, ó 3 días después de la electroporación de la morfolino. El control de morfolino no reprimir la expresión de PCNA aumento en las retinas dañadas por la luz. El morfolino anti-PCNA eficiente derribaron la expresión de PCNA proteínas a través de tres días de daño constante de luz intensa. Figura 6. Esquema (izquierda) muestra la enucleación del ojo para pLABORACIÓN y muestras criostáticas, que se realiza a lo largo del eje dorsal ventral. La caja de color rosa con sombra (derecha) muestra la región de la retina con la mayor cantidad de caída de proteínas utilizando esta técnica. Las casillas sombreadas azules representan áreas que son más a menudo dañados por el caso de la electroporación. La orientación del ojo tiene la etiqueta anterior (A), posterior (P), dorsal (D) y ventral (V).