Skeletspieren Geslacht dimorfisme van Proteomics

1. Monstervoorbereiding Gebruik verse, bevroren of flash-RNAlater behandelde weefsel van muizen als uitgangsmateriaal. Blot weg overtollige conserveermiddel met een Kimwipe voordat u verder gaat. Verwijder alle pezen en fascia rond de spier en gehakt van het weefsel met enkele scherpe scheermesjes voor 2 min op gekoeld glas platen in een koude kamer (4 ° C) totdat het weefsel is goed gehakt of poedervormige. Verzamel het monster in een vooraf gewogen microfugebuis en bepalen het gewicht van het weefsel. Gebruik niet meer dan 10 mg van het weefsel als uitgangsmateriaal. Voeg 45 ul extractiebuffer (8 M ureum, 50 mM DTT, 4% CHAPS, 0,2% drager amfolyten 5 / 8, 0,0002% broomfenolblauw) per 1 mg gehakt weefsel, bij kamertemperatuur. Als het volume groter is dan 350 pL, 350 pL in eerste instantie toe te voegen en gehomogeniseerd (stap 1.4), voeg dan de rest van de buffer om spatten te minimaliseren. Homogeniseren het weefsel zeven keer met een gemotoriseerde stamper (Kontes Corp) gedurende 15 seconden bij4 ° C, met twee minuten afkoelen op ijs tussen elke homogenisering. Centrifugeer de monsters bij 15.600 xg gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Bewaar het supernatant en meet het volume. De cel puin pellet wordt weggegooid. Neerslaan van de eiwitten in het supernatant met ijskoude reagens-grade aceton (3 keer v: v-verhouding). Vortex de buizen gedurende 15 seconden. Centrifuge voor 15.600 xg gedurende 10 seconden tot pellets vormen, en resuspendeer in extractie-buffer met de Kontes motor en polypropyleen roerstaafjes (BioSpec Prod) Herhaal stap 1.6. Ofwel door te gaan met eiwitconcentratie schatting van de monsters of bewaar ze bij -20 ° C. 2. Eiwitconcentratie schatting Gebruik maken van de Lowry assay 7 of de BCA assay 8 (Pierce), streven naar ongeveer 4,5 mg ml -1. 3. Iso-elektrische focussering Verwijder een ReadyStrip IPG strip (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)van -20 ° C en laat het bij kamertemperatuur equilibreren voor 10-15 minuten. Vortex het monster en pipet 600-800 microgram (totaal volume 200 pi) eiwit monster in een rechte lijn aan de achterkant van een kanaal in de steekproef rehydratie lade, waardoor ongeveer 1 cm aan elke kant. Met behulp van een tang, trek het plastic deksel van de IPG strip – zorg ervoor dat alleen de uiteinden van de strip handvat en elk contact met de gel te voorkomen. Let op de basic einde van de strip en plaats deze aan de linkerkant van de lade. Plaats de IPG strip gel-kant naar beneden op de top van het monster, te voorkomen vangen bubbels eronder. Laat het hydrateren voor een uur. Overlay met 2,5 ml minerale olie (BioRad). Bedek de lade met het deksel, en laat een nacht hydrateren bij kamertemperatuur. Plaats een papieren lont aan beide uiteinden van de focus lade kanaal en nat elk met 10 pi Millipore water. Haal IPG strip en houd verticaal gedurende ongeveer 10 seconden de afvoer van de olie. Blot de plastic backing met een Kimwipe. Plaats de IPG strip gel naar beneden en met basis einde aan de links in de aandacht geplaatst. Bedek de strip met 2,5 mL minerale olie. Plaats de lade in de proteïsche IEF cel (Bio-Rad) en het programma een drie-stappen-protocol (tabel 1) bij gebreke cel temperatuur van 20 ° C, een maximale stroom van 50 uA / strip, en geen rehydratatie tijd. Spanning Tijd Volt-Hrs Helling Stap 1 250 20 min Lineair Stap 2 8000 2,5 uur Lineair Stap 3 8000 40000 Snel Totaal 6,5 uur 40000 Tabel 1. Drie-stappen-protocol van Protean IEF cel voor 11 cm IPG strips. Neem de IPG-strips uit de IEF cel met behulp van een tang. Blot de kunststof achterplaat met een Kimwipe en plaats de IPG strip gel kant naar boven in een schone rehydratatie lade. U kunt de dekking van de rehydratatie lade en wikkel het af met plasticfolie en bewaar bij – 80 ° C of door te gaan. 4. SDS-polyacrylamide gel elektroforese Breng de strip (gel kant naar boven) in een 11 cm equilibratie lade. Voeg 4 mL van vermindering buffer (6 M ureum, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2% DTT) om het kanaal en equilibreren de strip gedurende 10 minuten met milde schudden. Verwijder de vermindering buffer, voeg 4 mL van alkylering buffer (6 M ureum, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8,8, 20% glycerol, 2,5% joodacetamide) en equilibreren de strip gedurende 10 minuten met milde schudden. Spoel de IPG strip door dompelen de strip kort in 1 X SDS lopen buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,2). Leg de strip gel kant naar boven op de achterplaat van de 11 cm Criterium pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS-polyacrylamide gel (Bio-Rad) en voorzichtig in, zodat duw dat zij volledig op contact met de SDS gel maakt; zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de twee gel oppervlakken. Overlay van de IPG strip met 1 ml van gesmolten agarose-oplossing (0,5% agarose, 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, broomfenolblauw) en laat de agarose stollen gedurende 5 minuten. Belasting 5 pi van eiwit marker 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) in de bedrijfstoeslagregeling en moleculair gewicht normen. Voer de gel in SDS buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS, pH 8,2) bij 200 V bij kamertemperatuur of in een koude ruimte (4 ° C) met de broomfenol blauwe kleurstof voor migratie naar de elektroforese monitor. Haal de gel uit de plastic cast en vlekken 's nachts door schudden zachtjes in Coomassie Brilliant BlueR-250 vlek (45,5% methanol, 45,5% dH2O, 9,0% azijnzuur, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). Schud de gel in Destain een oplossing (45,5% methanol, 45,5% dH 2 O, 9,0% azijnzuur) twee keer voor elk 3 uur en in Destain 2 (5% methanol, 90% dH 2 O, 5% azijnzuur) 's nachts. Bewaar de gel in 7% azijnzuur voor analyse. 5. Gel beeldvorming en analyse Maak foto's van de gels met behulp van de hoeveelheid een software programma dat het VersaDoc imaging-systeem (BioRad) werkt. Gelijkmatig de afbeelding bijsnijden gebieden voor alle gels in uw experiment. Laad de bijgesneden beelden op de PDQuest 8.0-software-programma om een ​​experiment te creëren. Volg het Experiment Setup Wizard om de parameters voor spot detectie en spot matching over de gels te definiëren. Inspecteer en verfijnen ter plaatse overeenkomende resultaten handmatig indien nodig. Uit te voeren kwantitatieve en statistische analyse van de gels aan aangepast eiwit plekken te detecteren met two-voudige of hoger statistisch significante verschillen in expressie tussen de twee gel groepen. Maak een analyse van deze plekken van belang en knip ze uit met behulp van een EXQuest plek snijder (BioRad) voor trypsine spijsvertering en LC-MS-eiwitten identificatie. 6. In-gel tryptische spijsvertering Voor deze stap een aangepaste Pierce In-Gel Tryptische Digest Kit (# 89871X, Pierce) protocol wordt gebruikt. Voeg 200 ul van ontkleuroplossing (25 mM ammoniumbicarbonaat, 50% acetonitril) om de gel pluggen. Vortex en incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 30 minuten met schudden. Verwijder voorzichtig en gooi de oplossing. Herhaal stap 6.1. Voeg 30 ul van vers bereide verminderen buffer (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfine, 22,5 mM ammonium bicarbonaat) aan de buizen die de gel stekkers en incubeer bij 60 ° C gedurende 10 minuten. Laat monsters afkoelen en verwijder en gooi het verminderen van buffer. Voeg 30 ul van alkylering buffer (100 mM joodacetamide, 20 mM ammoniumbicarbonaat, onmiddellijk bereid door vóór gebruik in folie gewikkelde buizen. Incubeer de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder de alkylering buffer. Was de gel pluggen door het toevoegen van 200 pi van ontkleuroplossing aan elke buis. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Verwijder de ontkleuroplossing en herhaal de wassen. Voeg 50 ul van acetonitril om de gel te pluggen en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om hen in staat te krimpen drogen, verwijder dan zorgvuldig de acetonitril. Herhaal stap 6.8 nog een keer. Gel stukken moeten kijken wit en klein. Laat gel stukken te drogen in een Centrivap Concentrator (Labconco, Model EX1245) voor 10 minuten. Swell de gel stukken door het toevoegen van 10 pi van geactiveerde trypsine oplossing (10 ng / ul trypsine, 25 mM ammonium bicarbonaat). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Voeg 25 ul spijsvertering-buffer (25 mM ammoniumbicarbonaat) aan de buizen. Incubeer de monsters overnacht bij kamertemperatuur onder schudden. Sonificeer de monsters gedurende 10 minuten (Branson, bad ultrasoonapparaat model 2510) en spin ze neer voor het verwijderen van het supernatant naar een nieuwe buis. Sla het supernatant. Om verder te extraheren peptiden, voeg 10 pi van 0,1% mierenzuur en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. Sonificeer de monsters gedurende 10 minuten, verzamel de bovenstaande vloeistof en combineren met opgeslagen supernatant in stap 6.13. 7. Microschaal ontzouten van peptide extracten Verwijder ammoniumbicarbonaat en andere zouten in het peptide extracten met de hulp van PepClean C-18 Spin Columns (ThermoFisher) volgens de instructies van de fabrikant. Elueer peptiden tweemaal met 20 pi 70% acetonitril, verdampen de monsters droog door centrifugeren in de Centrivap Concentrator voor 1 uur en resuspendeerde peptiden in 10 pi 0,1% mierenzuur voor MS-analyse. 8. Eiwit identificatie met behulp van HPLC-gekoppelde massaspectrometrie Afzonderlijke 5 pi van het peptide mengsel op een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) meer dan 40 minuten, met behulp van een lineaire 20-50% acetonitril verloop met 0,2% mierenzuur op een Pepswift monolithische PS-DVB-kolom (Dionex) gekoppeld aan een nanospray I bron op een ion trap massaspectrometer (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) bij een debiet van 400 nL / min aan het uiteinde. Detecteren peptide MS1 signalen tussen 400 – 1400 m / z en laat voor de drie meest intense ion pieken worden geïsoleerd voor MS2 sequentiebepaling door CID met dynamische uitsluiting. Voor eiwit identificatie, het analyseren van de resultaten via een peptide Sequest muis referentie-database zoeken (BioWorks software, Thermo Fisher Scientific-) met een statische gealkyleerde cysteïne modificatie en dynamische wijzigingen voor de fosforylering (serine, threonine, tyrosine), methylaVerordening (histidine), oxidatie (methionine), ADP-ribosylering (arginine), en N-terminale acetylering. Van toepassing zijn conservatieve matching criteria (bv., peptide tolerantie ingesteld op 2 AMU en 1,00 fragment tolerantie, eiwitten bevatten tenminste twee peptiden het passeren van een Xcorr vs Charge Staat filter [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00] en een kans van p <0,05) 5 en handmatig controleren van de MS-spectra voor vertrouwen eiwit identificatie. 9. Representatieve resultaten: Mannelijke en vrouwelijke niet-uitgeoefende, was murine skeletspieren (biceps brachii) geëxtraheerd en gescheiden in een twee-dimensionale kaart 5, het eerste niveau van de spier vergelijkende proteoom (figuur 2). Zodra gevisualiseerd met behulp van hoge-resolutie digitale imaging; ongeveer 800 eiwitten plekken werden gedetecteerd in elk. Met behulp van de mannelijke proteoom kaart als een baseline, is het duidelijk dat er tal van plekken die in overvloed verandering in de vrouwelijke proteoom. De plek intensiteiten zijn maatregelen van de verandering in het eiwit bedragen (figuur 3). De identiteit van het eiwit plekken die verandering meer dan twee-voudige (omhoog of omlaag) en zijn statistisch significant (p <0,05) met een n = 5 muizen, worden bepaald door aminozuur sequentie analyse met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie gekoppeld. Deze resultaten tonen aan dat vrouwen een overvloed afname van suiker energie-metabolisme enzymen en in creatine kinase (CK) isovormen, een ander systeem voor energievoorziening in de spieren aan te tonen. Zowel mensen als dieren weer meer voor bij mannen serum CK-spiegels in rust en na de uitoefening 9,10, maar serum CK-waarden niet noodzakelijk correleren met het bedrag van de myofibrillar verstoring 11,12. Dit geslacht dimorfisme in de cellulaire overvloed van CK in muriene biceps brachii spier is een nieuw finding5 en kan antwoord geven op de fysiologisch serum CK verschillende niveaus. Cijfers: g1.jpg "/> Figuur 1. Een algemeen schema van het protocol voor vergelijkende proteomics. Het protocol is onderverdeeld in drie groepen: de monstervoorbereiding, monsteranalyse en, eiwit identificatie. De uiteinden van elk van deze drie groepen van de protocollen zijn ook redelijk pauzeren plaatsen, hoewel de beste resultaten worden vergaard als de totale protocol wordt uitgevoerd zonder te stoppen. Figuur 2. Vergelijking van de vrouwelijke muizen biceps brachii eiwit plekken ten opzichte van de identieke plekken in mannelijke biceps brachii (groene cirkels o). Spots dat een toename van groter dan of gelijk aan twee keer bij vrouwen zijn omcirkeld rood (o) en degenen die minder dan of gelijk aan twee-maal verlaagde zijn omcirkeld blauw (o). Figuur 3 Gel Spot Intensiteit Analyse:. X-as, vrouwelijkepre-oefening (controle, n = 5), Y-as, vrouwelijke single bout 0 uur tijdstip groep (n = 5). Regressielijn: correlatiecoëfficiënt = 0,919; helling = 0,976; onderscheppen = -0,0293. Spots boven de rode lijn en onder de blauwe lijn te veranderen meer dan + / – twee-voudige.