Spectrale confocale beelden van de fluorescent gelabeld nicotinereceptoren in de knock-in muizen met chronische Nicotine Administratie

Ligand-gated ionkanalen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn betrokken bij tal van aandoeningen met ernstige medische en sociale gevolgen. Bijvoorbeeld, de verslaving aan nicotine via het roken van tabak is een belangrijke oorzaak van vroegtijdig overlijden wereldwijd (World Health Organization) en wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een wijziging van ionkanaal distributie in de hersenen ^1. Chronische blootstelling aan nicotine in zowel knaagdieren als mensen resulteert in een verhoogd aantal nicotine acetylcholine receptoren (nAChRs) in het hersenweefsel ^1-3. Ook hebben veranderingen in de glutamaterge GluN1 of GluA1 kanalen zijn betrokken bij het ​​ontstaan ​​van overgevoeligheid voor andere verslavende drugs zoals cocaïne, amfetamines en opiaten ^4-6.

Bijgevolg is de mogelijkheid om in kaart te brengen en te kwantificeren distributie en expressie patronen van specifieke ionkanalen is van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van verslaving. De studie van de hersenen regiospecifieke effecten van individuele geneesmiddelen werd voorgeschoten door de komst van technieken zoals radioactieve liganden. De lage ruimtelijke resolutie van radioactieve ligand verhindert de aan ligand ionen kanalen kwantificeren specifieke subtypen van neuronen.

Genetisch gecodeerd fluorescerende verslaggevers, zoals groen fluorescerend eiwit (GFP) en de vele kleur varianten, hebben een revolutie teweeggebracht op het gebied van de biologie ^7. Door genetisch tagging een tl-reporter is een endogeen eiwit kan men eiwitten visualiseren in vivo ^7-10. Een voordeel van fluorescent tagging eiwitten met een sonde is de eliminatie van antilichaam gebruik, die vraagstukken van nonspecificity en de toegankelijkheid van het doelwit eiwit hebben. We hebben gebruik gemaakt van deze strategie om fluorescent label nAChRs, die de studie van receptor montage met behulp van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) in getransfecteerde gekweekte cellen ¹¹ ingeschakeld. Meer recent hebben we de knoc gebruiktk-in benadering van de ingenieur muizen met geel fluorescerend eiwit gelabeld α4 nAChR subeenheden (α4YFP), om een nauwkeurige kwantificering van de receptor ex vivo bij submicrometer resolutie in CNS neuronen via spectrale confocale microscopie ^12. De beoogde fluorescerende knock-in mutatie is opgenomen in de endogene locus en onder controle van de oorspronkelijke promotor, de productie van normale niveaus van expressie en regulatie van de receptor in vergelijking met niet-gecodeerde receptoren in wildtype muizen. Deze knock-in benadering kan worden uitgebreid tot fluorescent label andere ionkanalen en biedt een krachtige aanpak van het visualiseren en kwantificeren van receptoren in het CZS.

In dit artikel beschrijven we een methode om veranderingen in de nAChR expressie te kwantificeren in specifieke CNS neuronen na blootstelling aan chronische nicotine. Onze methoden zijn onder andere mini-osmotische pomp implantatie, intracardiale perfusie fixatie, beeldvorming en analyse van fluorescent gelabeld nicotinezuur receptor subunits uit α4YFP knock-in muizen (afb. 1). We hebben geoptimaliseerd fixatie techniek autofluorescentie minimaliseren van vaste hersenen tissue.We in detail onze imaging methode met een spectrale confocale microscoop in combinatie met een lineaire spectrale ontmenging algoritme autofluoresent signaal aftrekken om nauwkeurig verkrijgen α4YFP fluorescentiesignaal beschrijven. Tot slot tonen we de resultaten van chronische nicotine geïnduceerde opregulatie van α4YFP receptoren in de mediale perforant pad van de hippocampus.