Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti
Summary
Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l'individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.
Abstract
Rilevamento e prima trasformazione del fisico, chimico e termico di stimoli sensoriali periferici fibre nervose sensoriali è la chiave per la percezione sensoriale negli animali e nell'uomo. Queste fibre nervose sensoriali periferici esprimere un gran numero di recettori e proteine canale ionico che individuare e avviare specifici stimoli sensoriali. I metodi sono disponibili per caratterizzare le proprietà elettriche delle fibre nervose sensoriali periferici che innervano la pelle, che può anche essere utilizzato per identificare l'espressione funzionale di specifiche proteine canale ionico in queste fibre. Tuttavia, simili metodi elettrofisiologici non sono disponibili (e sono anche difficili da sviluppare) per la rilevazione della espressione funzionale dei recettori e proteine canali ionici in periferici che innervano le fibre nervose sensoriali altri organi viscerali, compresi i tessuti più difficili come le ossa. Inoltre, tali metodi elettrofisiologici non può essere utilizzato per determinare l'espressione di proteine non-eccitabilis nel periferico fibre nervose sensoriali. Pertanto, immunocolorazione di campioni di tessuti periferici / viscerale per fivers nervo sensitivo fornisce il modo migliore per determinare l'espressione di specifiche proteine di interesse in queste fibre nervose. Finora, la maggior parte studi di espressione della proteina nei neuroni sensoriali hanno utilizzato immunostaining procedure nei gangli sensoriali, dove si limita l'informazione per l'espressione di specifiche proteine nel corpo cellulare di tipi specifici o sottoinsiemi di neuroni sensoriali. Qui riportiamo metodi dettagliati / protocolli per la preparazione di campioni di tessuto periferico / viscerale per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Noi specificamente metodi dettaglio per la preparazione della pelle o plantare biopsia e ossa (femore) sezioni di topi per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Questi metodi non sono solo la chiave per la determinazione qualitativa di espressione della proteina nei neuroni sensoriali periferici, ma anche fornire un metodo quantitativo di analisi perdeterminare i cambiamenti nei livelli di espressione della proteina in tipi specifici o sottoinsiemi di fibre sensoriali, nonché per determinare i cambiamenti morfologici e / o anatomiche del numero e della densità delle fibre sensoriali durante vari stati patologici. Inoltre, questi metodi non si limita alla colorazione di un solo fibre nervose sensoriali, ma può anche essere utilizzato per la colorazione qualsiasi tipo di fibre nervose della pelle, ossa e altri tessuti viscerali.
Protocol
Discussion
Qui abbiamo dettagliato i metodi per la preparazione della cute del topo e sezioni di tessuto osseo per immunocolorazione e il rilevamento di periferiche fibre nervose sensoriali. Le sezioni prodotte da plantare biopsie contengono sia la pelle glabra e peloso, che significa che il protocollo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di pelle. Queste tecniche possono anche essere impiegati per macchiare altri tipi di cellule in questi tessuti (es. leucociti, endoteli vascolari, muscolari lisce tra gli altri). Questi metod…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. M. Yuriy Usachev per il suo aiuto nella standardizzazione iniziale di microscopia confocale / immagini di mouse plantare immunocolorazione biopsia, e il dottor Donna L. Hammond per il suo continuo aiuto e critica costruttiva in questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NINDS / NIH (NS069898), e uno Sviluppo Idea Award Concessione da parte del Dipartimento di Ricerca della Difesa Prostate Cancer Program (DoD-PCRP-101096) per Data Protection Manager
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue No. | Comment |
| 3mm Harris Micro-Punch | Material | Ted Pella | 15094 | |
| Perfusion pump | Material | VWR International | 23609-170 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Fisher Scientific | T353 | |
| Picric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | 239801 | |
| OCT Embedding compound | Reagent | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cyto-Freeze cryogenic aerosol spray | Material | Control Company | 3118 | |
| Goat Serum | Reagent | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Incubation tray and lid for Immunostaining (Large) | Material | RPI Corp. | 248270 (tray) 248270-A (lid) |
|
| ImmEdge hydrophobic barrier pen | Material | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Camel’s Hair Brushes (#1 thickness) | Material | Ted Pella | 11859 | |
| Pro‐Long Gold Mounting medium | Reagent | Invitrogen | P36930 |
Referencias
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