Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

1. Mikroçip üretim SU8 ana imalat. 30 sn için 3000 rpm'de Si gofret 40 mikron yükseklik, spin kat SU8-50 (MicroChem Corp) mikroakışkan kanalları elde etmek için Yumuşak fırında sıcak bir plaka üzerinde 65 ° C 5 dakika ve 95 ° C, çözücü buharlaşması ve film sıkıştıracağını 30 dakika. Soğuduktan sonra, uygun bir maske altında SU8 300 mJ / 2 360-440 nm radyasyon ile karşı maruz kalmaktadır. Maruz kalındıktan sonra, gofret fırında 65 ° C için 2 dakika 4 dakika ve 95 ° C Soğuduktan sonra, karıştırarak, 5 dakika boyunca maruz kalmamış alanlarda (Micrpoposit EC solvent Chestech) gelişir. Kullanın 5 taze gofret yıkayın ve temiz bir yüzey oluşturmak için gaz altında kuru çözücü EC. Hekzan ve metanol yıkar ile gofret davranın. Yüzeyine silan trikloro buharlaşan bir son adım (1,1,2,2-perfluoocytl) (40 dakika desikatöre), SU8 ana üretim süreci tamamlayın. PDMS curing dicing ve delik delme. Yapılandırılmış mikroakışkan substratlar formu için master üzerine dökün ardından çapraz bağlayıcı reçine 10:1 (w / w) oranı Sylgard 184 (Dow Corning) karışımı ve. Bir saat sonra bir desikatöre Degas ve 65 tedavi cihazı (üst tabaka) ° C Ana kapalı tedavi PDMS ve kabuğu kesin. Akışkan borular için biyopsi yumruk kullanarak erişim delikleri oluşturun. Kür, 65 yaşında, 20 dakika boyunca PDMS başka bir katman (10×10 cm Petri kabındaki eşit olarak yayılan reçine 8 g) ° C Alt tabakasına hazırlanan üst tabaka yerleştirin ve daha sonra 65 yaşında bir gecede tedavi ° C Kullanmak için Petri kabı ve zar yongaları Peel. 2. Deney düzeneği Mikroakışkan kurulum Hortumun herhangi bir yerinde herhangi bir hava kabarcığı kalır sağlamak, gerekli çözümleri ile şırınga (plastik veya cam Beckton, Dickinson and Company veya SGE Analitik Bilim) doldurun. Damlacık üretimi için iki aşamadan kullanılır. Sulu (dağınık) phase ilgi reaktifler (örneğin büyüme ortamında bir hücre süspansiyon, ya da moleküler fluorophores bir çözüm) içerir. Bu durumda sürekli faz gibi davranır yağ fazında, genellikle petrol ve sürfaktan bir karışım, florlu yağı örneğin% 2 Raindance sürfaktan (Raindance Teknolojileri) (3M Fluorinert Elektronik Sıvı FC-40) oluşur ya da% 2 Açıklığı 80 Mineral yağ (Croda). Fit bir ucunda iğneler şırınga iğne uçları aynı iç çapı boru (Polietilen borular, Harvard Apparatus). Boru, titreşim tedirginlikler nedeniyle akış kararsızlıkları en aza indirmek için mümkün olan en kısa uzunlukta kesilmiş olmalıdır. Hortumun diğer ucu doğrudan PDMS substrat delikli deliklere takın. Silika kapiller liman veya bağlayıcılar (örneğin Upchurch Nanoports) kullanımı gibi daha karmaşık çözümler mikroakışkan cihazı ve tüp arasında daha sağlam bir arabirimi için de uygulanabilir. Prize bağlayınçipin bir koleksiyoncu (çöp toplama ya da daha fazla analit işleme) tüp ve doğrudan bağlantı noktası. Mount bir şırınga pompası (örneğin PHD 4400 Hpsi programlanabilir şırınga pompaları, Harvard Apparatus) şırınga ve her aşaması için (genellikle dakikada mikrolitre sırasını) istenilen beslerken akış hızı tanımlamak. Yağ 1 / sulu akış oranları bir asgari oran, kararsız damlacığı oluşumundan (cihaz geometri bağlı olarak) yol açacak sulu faz, PDMS ıslatma önlemek için tavsiye edilir. Aynı nedenden ötürü, aynı zamanda sulu faz giriş ilk önce, herhangi bir mikroakışkan kanallar aracılığıyla, yağ fazı tek başına temizlemek için tavsiye edilir. Deneyler Burada kullanılan son kurulum Şekil 2a gösterilmiştir. Optik sistem kurulumu Konfokal mikroskobu (otomat ile küçük hacimlerde yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip mikroakışkan kanalları içinde (birkaç pikolitre) probed Mikronaltı konumlandırma kapasite). Yüksek kuantum verimi ile ideal bir floresan moleküller suda çözünebilen kullanın. Excite ilgili fluorofor emme eşleşen bir dalga boyunda bir lazer işletim kullanarak moleküller. Örneğin, floresein 5-izotiyosiyanat (FITC) ve Alexa Fluor 488 gibi sık kullanılan floresan moleküller verimli bir 488 nm diyot lazer (örneğin PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485) kullanılarak heyecan olabilir. Floresan moleküller, Texas Kırmızı veya Allophycocyanin (APC) gibi verimli bir şekilde kullanarak 633 nm çıkılabilir He / Ne lazer (örneğin Newport R-31.425). Tekrarlama oranları birkaç MHz (çeşitli ns darbe ayırımlar) ve Floresan Ömür Boyu Görüntüleme (Flim) deneyleri için yeterince farklılaşmış bir ömür boyu özellikleri ile fluorophores çalışan darbeli lazerler kullanın. Kiriş direksiyon aynalar ve optik kiriş yüksekliğinin yanı sıra ışın yönünü kontrol etmek için kullanın. Nesnel l içine lazer ışınını bir dikroik ayna kullanınEns. Aynı anda iki lazer kullanılırsa, bir dual-band dikroik ayna yansıması iki lazer ışınları (z488/633rdc Chroma Technology Corporation bir ayna ideal örneğin 488 ve 633 nm kirişler için) izin için monte edilebilir. Mikroakışkan bir kanal içinde sıkı bir odak lazer ışığı getirmek için sonsuz düzeltilmiş, yüksek sayısal açıklık (NA) mikroskop objektif (yani Olympus 60 x / 1.2 NA, suya daldırma) kullanın. Uzun boylu mikro (> 100 mikron) ile çalışırken kullanılan nesnel uygun çalışma mesafe Mikrokanallı tam yükseklikte etkili kapsar olmasını sağlamak için seçilmiş olması gerekir. Aynı yüksek NA, aynı dikroik ayna aracılığıyla iletilen amaç ve (mikroakışkan kanal içinde) kullanarak örnek tarafından yayılan floresan toplayın. Tek veya çift-bant emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir z488/633 filtre) kullanarak herhangi bir kalıntı uyarma ışık çıkarın. Focus floresan emission bir yüzü düz diğeri dışbükey mercek (örneğin 50,2 F Newport Ltd) ile 75 mikron bir iğne deliği üzerine. Konfokal mikroskop objektif düzlemde iğne deliği yerleştirin. Iki dedektör üzerine floresan sinyal bölmek için başka bir dikroik ayna (örn. 630dcxr, Chroma Technology Corporation) kullanın. Bir emisyon filtresi (örneğin hq540/80 m Chroma Technology Corporation bir filtre) ile dikroik ayna tarafından yansıtılır floresan Filtre ve yüzü düz diğeri dışbükey lens ile odak (örneğin f = 30.0 id 25,4 mm, Thorlabs) ilk üzerine ( 'Yeşil') dedektörü. Ikincil bir kırmızı fluorofor ilgili deneyler başka bir emisyon filtresi (örneğin Chroma Technology Corporation bir hq640lp filtresi) ile dikroik ayna tarafından gönderilen floresan filtre ve daha sonra ikinci dedektörü ('kırmızı') üzerine başka bir yüzü düz diğeri dışbükey lens odak. Floresans fotonu tespiti için çığ fotodiyotlar (örneğin AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) kullanın. Son kurulum gösterilmiştir. <strong> Şekil 2b. 3. Damlacık üretimi ve veri toplama Damlacık nesil yöntemleri Bu damlacıkları oluşturmak için iki ana yapılandırmaları mikro kullanabilirsiniz: oluşan damlacıklar Mikrokanallı kendisi kadar geniş olduğu sürece Her iki yöntem de eşdeğer bir akış biçimi (Şekil 3a ve 3b) 6,7 odaklanma ya da T-kavşak. Sonuç olarak, iki karışmayan sıvılar bir araya getirmek ve arayüzü geliştirmek sonraki kılcal kararsızlıkları, monodisperse damlacıkları (birkaç Femtolitreden gibi küçük) kendiliğinden oluşturulur bu geometriler kullanarak ortaya çıkan kesme kuvvetlerinin. Farklı şekillerde reaktifleri sarabiliriz: reaktifler hazırlanan ve karışık çip kapalı istenilen karışımı / konsantrasyon, ya da damlacık formasyonu (Şekil 3c) önce araya gelerek ayrı ayrı çip haline getirdi ve olabilir olabilir . Bukarışımları / konsantrasyonları sadece göreceli akış oranlarını ayarlama değiştirilebilir yılından bu yana son yöntem daha yüksek esneklik sağlar. Bu hücre kapsülleme, şırınga içinde hücre süspansiyonu, zaman ölçeği üzerinde deney hücrelerinin yoğunlaşmayı önlemek için karıştırılır gerektiğini kaydetti. Floresan veri toplama. Veri çığ fotodiyot dedektörü, (2.2.12 açıklanan), çok işlevli bir DAQ cihaza çift elektronik sinyal günlüğü (örneğin, bir PCI 6602, National Instruments), kişisel bilgisayar üzerinde çalışan. Flim deneyler Zaman İlişkili Tek Foton Sayma dedektörleri bağlamak için (TCSPC) kartı (örneğin TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) ayrı bir PC üzerinde çalışıyor. Algılanan her floresan foton bir olay lazer darbe ilişkili olduğu ve bu nedenle her yayılan floresan foton bir gecikme süresi atanır: Bu kart bir TCSPC metodoloji kullanılarak elde edilecek floresans ömrü veri sağlar. Bu verilerfluorofor / s ışınımsal oranı katsayısı / s bir kestirim elde etmek için bir tek veya çok-üstel bozulma eğrisinin takılabilir Dedektörün cihaz tepki fonksiyonu (IRF) ham verileri Deconvolute: Bu düşük bir konsantrasyon Auramine-O çözüm (birkaç piko bir floresan ömür boyu sergiler) kullanılarak elde edilmiştir 8. 4. Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama Damlacıklar içinde karıştırma hücre tanıma ve haritalama Escherichia coli En canlılığı testi deney için 10 suşu kullanın. Kültür gecede Luria Bertani suyu hücreleri ve deneylere önce 0.5 optik yoğunluk maç. 0.4 mcM SYTO9 ve 1 mcM propidium iyodür hücrelerin canlılığı saptamak için kullanın. Her ikisi de DNA intercalating boyalar ve onların floresan DNA'ya bağlanarak üzerine 20 yılı aşkın bir kat artar. SYTO9 beni bir yeşil floresan boyambrane geçirgen ve propidium iyodür membran geçirimsiz bir kırmızı floresan boya. Canlı hücrelerin ölü hücreleri, hem de 'yeşil' ve 'kırmızı' emisyon sergi Böylece 'yeşil' floresan. Kırmızı / yeşil floresan tespiti için 2.2 tanıtıldı setup) kullanın. Taşınabilir bir mini-manyetik karıştırıcı (Utah Biyodizel Kaynağı, Utah), hücre sedimantasyon önlemek için bir 7mm manyetik karıştırıcı ile donatılmış bir 3ml BD plastipak şırınga içinde hücre süspansiyonları karıştırmak için kullanın. Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama Damlacıkları akan boyunca hangi bir Mikrokanallı yarım yükseklikte optik prob hacmi odaklanın. Iki sulu çözeltileri (Şekil 3c olarak), her biri farklı karakteristik floresan yaşamlarda (etkileşimli) fluorofor içeren formu damlacıkları . Kanalın bir tarafında başlayarak, 1 mikron aralıklarla kanal tüm genişliği boyunca her deney yürütmek. Kanal edsonra floresan yoğunluğu büyük ölçüde lazer ışını yakınlığı odaklı düştükçe ges kolayca tespit edilebilir. Yağ fazında gürültü arka sinyal patlamaları (damlacıkları ile ilişkili) ayırt etmek ve her patlama süresi kurmak için bir algoritma uygulanması. Deney yapılmıştır belirli bir genişlikte her damla uzunluğu boyunca gecikme süresi ve yoğunluğu değerleri çıkarmak için ikinci bir algoritmanın uygulanması. 9 Sonra deneyde her damla için floresans ömrü değerlendirmek için Maksimum Olabilirlik Tahmincisi (MLE) algoritmasını kullanır. 8 deneyde tüm damlacıkları için ömür boyu değerleri ortalama MLE hesaplama son hata (daha damlacıkları probed azaltır hata daha küçük). Bir ömür boyu yörüngesini her genişliği elde edildikten sonra, 2B harita tüm yörüngeleri birleştirir. Her bir özellikle yaşam boyu değeri ile ilişkili olduğundanlar iki fluorophores karışımı bir konsantrasyon (veya karıştırma) harita böylece elde edilebilir. İsteğe bağlı olarak, damlacık karıştırma 3D harita mikroakışkan kanal yüksekliği boyunca farklı pozisyonlarda bu protokol tekrarlayarak kolaylıkla elde edilebilir. 5. Veri analizi Ham deneysel veri dosyaları uygun bilgisayar diline yeniden yorumluyoruz böylece daha da analiz edilebilir (foton sayıları zamanla değişim içeren örneğin, metin dosyaları, veri işleme ve analiz için kolayca Matlab içine ekstrakte edilebilir). MLE algoritmaları çalıştırmak veya ömür boyu yörüngeleri karıştırma patters 2B haritalar oluşturmak için daha karmaşık denemeler dosyaları (Flim için olanlar gibi) veya sipariş yer alan verilere erişmek için özel bir kod yazmak zorunda kalabilirsiniz. 6. Temsilcisi Sonuçlar Hücre tanıma Tipik örnekler variation hücre tabanlı deneyler için zamanın bir fonksiyonu olarak foton sayısı iki yüz milisaniyelik bir süre içinde, Şekil 4a ve c gösterilmiştir. Önemlisi Luria-Bertani suyu (LB orta) sulu damlacık sınırlarını tanımlayan zayıf floresanlama bir arka plan olarak görür, tek tek hücrelerin varlığı ile ilgili ayrı bir foton patlamalarının ise bu arka plan üstüne ayırt edilebilir. LB floresan arka plan, yaklaşık dikdörtgen bir kesit (kırmızı ve yeşil noktalı çizgi ile işaretlenmiş) ile karakterize edilir. E. kaynaklanan floresan patlamaları tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) coli hücrelerinde göre damlacıklarının uzunluğu (40 mikron, 30 picolitres bir birime karşılık gelen) ve E. ile uyumlu arka plan damlacık olaylar, daha 30 kat daha kısa . coli hücreleri (1.5-2.0 mikron) 10 Çift kanallı tespit ileiyon sistemi, canlı hücreleri veya ölü hücrelerin varlığı, yeşil ve kırmızı kanalları analizi ayırt edilebilir. Şekil 4 b ve d damlacık başına hücre sayısını açıklayan olasılık dağılımı gösterir . Flim kullanarak karıştırma olayları haritalama Moleküler floresans ömrü sadece kimyasal çevre tarafından etkilenen bir birey fluorofor, kendine özgü bir özelliğidir. Buna göre ölçümler, konsantrasyon, uyarım yoğunluğu ve optik toplama gibi deneysel faktörler (bağımlı zaman entegre floresans ölçümleri, daha üstün çözünürlük ve hassasiyet ile çevre bilgileri (pH, sıcaklık, polarite ve viskozite gibi) elde etmek için kullanılır. verimlilik). 9,11 Yerde olduğu gibi sunulan, 8 di iki fluorophores kullanarak damlacıkları içindeki karıştırma desen haritası mümkündürfferent ömrü değerleri. 1 no'lu denklemde görüldüğü gibi iki (etkileşimli) floresan türleri içeren bir karışımı çürüme biexponential formu alacaktır: Bireysel yaşamlar τ1 ve τ2 olarak tanımlanan ve her bir bileşenin genlik sırasıyla α1 ve α2 tarafından verilmektedir. Ortalama ömrü, daha sonra şu şekilde tanımlanabilir: Β1 ve β2 her bir bileşenin fraksiyonu ve aşağıdaki gibi tanımlanır: Prob hacmi sabittir ve damlacıkları o konumda boyunca akan bu yana, ömür boyu bir yörünge uzunluğu boyunca bu özel genişlik damlacıklarının değerleri bu şekilde elde edilebilir. Averag belirli bir genişlik için karakteristik bir yörüngeŞekil 5a ed, 6000 damlacıkları arasında görülebilir. Kanalın tüm genişliği boyunca yörüngeleri birleştiren bir 2D konsantrasyonu (karıştırma) harita oluşmasına yol açar. Tipik bir sonuç Şekil 5b sunulmuştur. Damlacıkları çok sayıda arasında ortalama, standart hata, elde edilen sonuçların büyük ölçüde azalır (Şekil 5a% 95 güven aralığı, standart hata% 1) olabilir . Ömrü yörünge belirleme yöntemini tüm damlacıkları hemen hemen aynı olduğunu varsayar. Damlacıkları önemli ölçüde farklı olsaydı, elde edilen ortalama ömrü yörüngeleri (ve ortalama damlacıklarının uzunluğu boyunca ömür boyu sürekli keskin farklılıklar tespit edilir), daha az uzaklaşan profilleri düz olurdu: Bu iki ana nedenden dolayı, büyük ölçüde doğru olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, sonuçlar ne olursa olsun bireysel olarak tekrarlanabilir.damlacıkları analiz veya damlacıklar miktarı hesaplamalarında kullanılacak. 8 Şekil 1 mikroakışkan çip imalat süreci akış. Şekil 2, damlacık oluşumu için mikroakışkan yongası bağlı şırınga pompaları ve şırıngalar, temsil eden) Diyagramı, iki lazer için tipik bir optik kurulum b) şematik iki fluorofor (yeşil ve kırmızı) uyarma ve algılama . DC = Dikroik ayna, EM = Emisyon filtresi, L = Lens, PH = deliği, APD = Çığ fotodiyot dedektörü. Şekil 3. On-chip damlacığı oluşumundan stratejileri: a) akış odaklama yapılandırma; b) T-kavşak yapılandırma. c) dr çip kapsüllemebaşlangıçta ayrı iki sulu reaktifler oplets. Şekil 4 (a) ölüler için 0.2 s izleri Optik okuma ve (c), canlı hücreleri (hücre süspansiyonu için akış oranları: 1 ul dk -1, yağ: 2 ul min -1) . Her kemer şeklindeki sinyal kesik çizgiler ile işaretlenmiş damlacık sınırları, sulu damlacık formları zayıf floresan LB orta karşılık gelir. Yeşil sinyaller, 633 nm dalga boyları üzerinde 633nm ve kırmızı sinyaller altında okuma temsil eder. Hücreler DNA intercalating boyalardan kaynaklanan dikey başak tarafından ayırt edilir. (B) ölü hücreler ve (d) canlı hücreler için tek damlacıkları içinde hücre doluluk için olasılık dağılımı. Şekil 5 uzunluğu boyunca belirli bir genişlikte bir damlacık a) Tipik ortalama ömrü yörünge; b)(% FITC /% Str-AF488 olarak ifade ya da konsantrasyon), 2D bir ömür boyu harita içine damlacıkları tam genişliği boyunca bütün ortalama yörüngeleri kombinasyonu tipik gösterimi araştırdı.