Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

1. Ontdooien en het kweken van cellen Verkrijgen voorraad bevroren vereeuwigd N19-oligodendroglia cellen van de lange termijn vloeibare stikstof winkels. Dompel flacon met cellen bij 37 ° C waterbad tot de celsuspensie volledig ontdooid. Voeg 7 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) met een hoge-glucose aangevuld met 10% FBS (Foetaal Bovine Serum) en 1% penicilline / streptomycine tot een 10 cm cultuur plaat. Voeg de cel-suspensie druppelsgewijs op de plaat, en zachtjes en rock de Petri plaat gelijkmatig verspreiden de cellen bewegen. Cultuur-cellen bij 34 ° C / 5% CO 2 incubator. Na 4 uur, aspireer media van platen om eventuele resterende DMSO (dimethylsulfoxide), die was gebruikt als een cryoprotectant te verwijderen en te vervangen door vers medium (7 ml DMEM met hoge glucose media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine) . 2. Passage Cellen Bij 70-80%samenvloeiing (4-7 dagen groei), aspireer media uit cellen. Voeg 1 mL van 0,25% trypsine op de plaat. Pipet trypsine aan cellen (ongeveer 5 minuten) los te maken. Maak de juiste verdunningen voor experimentele condities en passage een extra 10 cm bord voor toekomstige experimenten in een cel dichtheid niet minder dan 0,1 x 10 6 cellen / ml. Opmerking: Je moet passage je cellen ten minste twee keer na het ontdooien alvorens ze te gebruiken voor experimenten. 3. Tellen en Plating Cellen Tot op het bord cellen voor live-cell imaging, trypsinize zoals eerder beschreven. Verwijder ongeveer 30 pi van cellen en tellen met behulp van een hemocytometer. Plaats een ongecoat glas dekglaasje in een 6 wells plaat. Voeg cellen om de put bij een dichtheid van 0,1 x 10 6 cellen / ml in 2 ml fenol-vrij DMEM met hoge glucose media, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine, bij 34 ° C / 5% CO 2. Toelatencellen een nacht (16-20 uur) groeien bij 34 ° C / 5% CO 2 voor transfectie. 4. Transfectie Combineer 100 pi serum-vrije media, 0,5-4 ug gezuiverd plasmide DNA, en 4 ul Fugene HD (Roche). Vortex voorzichtig te mengen. Vortex opnieuw kort en laat het DNA te complex voor 5 min bij kamertemperatuur, en voeg vervolgens Fugene HD DNA-mengsel rechtstreeks aan de gekweekte cellen. Kantel de plaat voorzichtig te mengen. De cultuur van de cellen voor een extra 48 uur bij 34 ° C / 5% CO 2 voorafgaand aan de behandeling of experimenten. 5. Voorbereiden Cellen voor live-cell imaging (LCI) Zet de LCI Chamlide live-cell instrument control box minimaal 1 uur voordat u wilt uw experiment te starten. De controle box regelt ook de temperatuur en luchtvochtigheid binnen de LCI Chamlide, en regelt de stroom van de voorgemengde 5% CO 2. Opmerking: Het is aan te raden omSchakel de control box tot 3 uur voor het begin van experimenten om ervoor te zorgen dat het hele podium 34 ° C bereikt Deze stap zal verminderen centraal drift, die wordt veroorzaakt door fluxulation en de thermische uitzetting van het metaal podium als het warmer wordt, tijdens de beeldvorming. Werken in een flow-kap, spray de Chamlide magnetische-type cultuur kamer, en pincet, met 70% ethanol en laat ze drogen gedurende 5 minuten. Verwijder de cellen van incubator en bevestigen dat ze gezond zijn. Dienen te worden opgenomen hechtend en goed verspreid over de glazen dekglaasje met tal van membraan-processen. Cellen die worden benadrukt door transfectie zijn niet geschikt voor experimenten, en zal een kleiner aantal van proces-extensies, en hebben vaak een onregelmatig gevormde kern. Kantel de 6-well plaat en verwijder het dekglaasje met een pincet. Plaats snel de dekglaasje cel omhoog in de bodemplaat van de cultuur kamer. Sta niet toe dat de dekglaasje om te drogen. Bevestig de magnetische belangrijkstelichaam van de cultuur kamer en voeg 500 ul van de media van de oorspronkelijke 6-wells plaat op de bovenkant van het dekglaasje aan. Hergebruik van deze media zal verminderen de hoeveelheid stress die op de cellen wordt veroorzaakt door veranderingen in het milieu, en kan ook nuttig zijn voor de beoordeling van extracellulaire uitgescheiden factoren. Plaats de glazen afdekplaat op de cultuur kamer. Gebruik een KimWipe gespoten met 70% ethanol om eventuele resterende materiaal te verwijderen van de bodem van het dekglaasje, die zouden interfereren met microscopie. Plaats de cultuur kamer in de 34 ° C / 5% CO 2 incubator gedurende 30 minuten. Deze stap zal ervoor zorgen dat de kamer zelf opwarmt tot 34 ° C te verminderen verschuiven van de dekglaasje als het metaal opwarmt. 6. Microscoop-instellingen Beelden werden hier verkregen met behulp van een Leica DMIRE2 omgekeerde microscoop met een aangepaste relais lens en de emissie filterwiel behuizing voor patroon laden van meerdere wielen (Quorum Technologies Inc, Guelph, ON). Helderveld – Lamp ingesteld op 2,5 V en de blootstelling tijd tot 240 ms. Rood Fluorescent Protein (RFP) – Gain vastgesteld op 140 voor 200 ms. Green Fluorescent Protein (GFP) – Gain vastgesteld op 140 voor 500 ms. Onze microscoop heeft een dimbare lamp in plaats van een draaiende schijf om de hoeveelheid licht beschikbaar om cellen te controleren. Wij voeren onze experimenten met het licht op 90% van de maximale lamp intensiteit. 7. De behandeling van cellen met apoptose inducerende en NucView 488 caspase-3 substraat Het is belangrijk om grote voorraden van apoptose inductoren voor te bereiden van tevoren en ze bevriezen in porties, zodat de concentraties zullen in overeenstemming zijn tussen de experimenten. De NucView 488 substraat is licht gevoelig. Bereid hoeveelheden van 15 ul te bevriezen / ontdooien, en op te slaan buizen te verminderen bij -20 ° C bedekt met aluminiumfolie. Werken met het omgevingslicht verlichting zo laag mogelijk om de blootstelling van de NucV te vermindereniew 488 substraat, licht voorafgaand aan het gebruik ervan. Snel ophalen van de cultuur kamer van de incubator, zodat de cellen niet worden blootgesteld aan een vermindering van de temperatuur. Plaats de cultuur kamer op de milieu-kamer van de microscoop en gebruik klemmen aan de cultuur kamer te houden van bewegen. Op dit moment moet je ook dimmen verlichting in de kamer. Zet de 5% voorgemengde CO 2 tank met dubbele regelaar. Met behulp van de 10x doel, focus aan cellen op de computer monitor met behulp van bright-field microscopie vinden. Opmerking: je zou willen om de grootste numerieke apertuur van het doel te gebruiken met de gewenste vergroting van de blootstelling te verminderen. Lever inductoren van apoptose van de cellen (in ons geval 80 mM kalium, of 100 mm glutamaat), kan een van de volgende methoden gebruikt. Wij zullen de levering van 80 mM kalium als een voorbeeld, met behulp van KCl opgelost als 10x concentraat in onze typische cultuur media. Media-uitwisseling by langzame en lokale perfusie: – Gebruik een peristaltische pomp uit te wisselen media in de cultuur kamer met nieuwe media die 80 mM kalium. – Het ene uiteinde van de slang zal leveren 10 ml van een voorraad van 80 mM kalium opgelost in fenol-vrij DMEM, en het andere uiteinde van de slang zal materiaal uit de kamer. – U wilt in ieder geval een 10x uitwisseling van media om ervoor te zorgen dat de media links in de kamer van de juiste concentratie van kalium is. – Na de media wordt uitgewisseld, voeg 3 ul NucView 488 substraat aan de media in de kamer. Pipet om te mengen. Directe toevoeging van 80 mM K + en NucView 488 substraat media in de cultuur kamer: – Maak een 10x voorraad oplossing van 80 mM kalium opgelost in fenol-vrij DMEM. – Voeg 3 ul van NucView 488 substraat aan 50 ul van 10x 80 mM kalium. Pipet om te mengen. Voeg toe aan 500 ul fenol-vrij DMEM in cultuur kamer. Let op: deze methode isde voorkeur als u geïnteresseerd bent in het handhaven of het beoordelen van de groei of andere afgescheiden factoren die aanwezig kunnen zijn in de originele media. We hebben gevonden dat de NucView 488 ondergrond stabiel is in celkweek voor experimenten duren zo lang als 36 h. 8. Live-cell imaging Klik op de rode kanaal om getransfecteerde cellen weer te geven. Selecteren en opslaan een tiental frames waar er meerdere getransfecteerde cellen, en sla deze "XY stage punten". Afhankelijk van de hoeveelheid computergeheugen, kunt u beperkt tot het aantal stage punten die u in staat zal zijn te verwerven. Hebben de microscoop beelden vastleggen (in bright-field, rode kanaal, en groene kanaal) in deze opgeslagen stadium punten om de 6 minuten. Elke groene vlekken die zichtbaar is tijdens de vroege stadia van de experimenten geeft aan waarschijnlijk cellen die al ondergaan apoptose, als gevolg meestal om transfectie en / of milieu-stress. Apoptosis als gevolg van de experimentele behandelingen worden gedetecteerd op een later tijdstip bepaald in het experiment. 9. Statistische analyse Voor elk experiment hebben we het programma van de microscoop om meerdere XY punten te behalen om een ​​grote dataset efficiënt te verzamelen. Elk experiment wordt uitgevoerd in dubbele of drievoud, en de gegevens zijn samengesteld uit verschillende experimenten uitgevoerd op verschillende dagen. Van elke dataset, krijgen we te analyseren om 15 terreinen van bekijken en vergelijken de verhouding van caspase-negatieve cellen om caspase-positieve cellen (totaal aantal cellen in het gezichtsveld / totaal aantal van caspase-positieve cellen). De opgenomen metingen van elke dataset zijn gegroepeerd in een grotere sample set en worden vervolgens met elkaar vergeleken met behulp van een ANOVA-tabel (p = 0,05). We tonen de standaardfouten van het gemiddelde (SEM) van elk experiment, en dan is het verschil in gemiddelden te vergelijken door het uitvoeren van een Tukey betekent vergelijkende test (p = 0,05) om te bepalen which behandelingen zijn significant verschillend van elkaar. 10. Representatieve resultaten We hebben beschreven een experiment om te illustreren hoe de NucView 488 substraat kan een verhoogde mate van apoptose van N19-OLG celculturen na een behandeling met een hoge extracellulaire kaliumconcentratie te geven. De N19-cellen werden getransfecteerd met RFP, en werden behandeld met 3 pi NucView 488 substraat (controle), of 3 pL NucView 488 substraat en 80 mm [K +] (behandeling). Cellen werden gecontroleerd en beelden werden verkregen over een 12 uur tijdsverloop, dat passend is voor studies met neurologische beledigingen (Figuur 1A). Tijdens controle omstandigheden, hebben we niet waarnemen significante hoeveelheden van apoptose in vergelijking met de 80 mm [K +] behandelde culturen (hashed box), die ongeveer 45% celdood toonden na 12 uur (Figuur 1B). De achtergrond groene signaal waarnemend in de controle-omstandigheden geeft de cellen die apoptose ondergaan zonder de toevoeging van extracellulaire kalium. Vrijwel geen van de cellen in het controle-experiment vertonen apoptose door de 12 h tijdstip, hoewel in andere situaties de experimenten kan nodig zijn om op langere termijn. Beelden werden verkregen met een 10x doelstelling. Bar = 100 urn. Figuur 1. (A) A 12 h tijdsverloop experiment van de N19 OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal), samen met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal). Kweken werden behandeld met een uiteindelijke concentratie van 80 mM [K +] (links panelen), of geen behandeling als een controle (rechts panelen). Beelden werden verkregen op 6 min interval, en een significante activatie van gesplitst caspase-3 (groen-signaal) kan waarnemend in culturen die werden behandeld met 80 mM [K +] in de cel kernen (hashed box) ten opzichte van het controle-experiment. (B) Percentage van de gesplitste caspase-3-cellen (berekend door het totale aantal cellen in het gezichtsveld door het totale aantal van caspase-positieve cellen). In vergelijking met omstandigheden controle, zagen we rond de 45% celdood na K +-behandeling door 12 uur svideo 1. Een 12 h tijdsverloop experiment van de N19-OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal) met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal), samen met bright-field beelden en een drie-weg samengevoegde afbeelding, na behandeling met 80 mM [K +]. svideo 2. A 12 h tijdsverloop experiment van de N19-OLG culturen 48 uur na de transfectie uitdrukken RFP-MBP (rode kanaal) met 3 pi van NucView 488 substraat (groene kanaal), samen met bright-field images en een drie-weg samengevoegde afbeelding. Geen behandeling werd toegepast op de culturen en de N19-OLGs kunnen zien migreren door de microscoop veld in tegenstelling tot de celculturen behandeld met 80 mm [K +] (vergelijk met svideo 1).