Opschaling van zoogdiercelculturen met behulp van een nieuw Meerlaagse Flask

1. Protocol bij Multi-Kolven gebruiken voor celcultuur De voorbereiding van de schepen en het toevoegen celsuspensie Bereid de celgroei medium als dat nodig is. Line up Multi-Fles verticaal op zijn kant met de dop naar boven op het werkvlak (steriel laminaire flow afzuigkap). Deze kolven zijn verkrijgbaar in 3 en 5-layer-formaten en het gebruik van een soortgelijk werk-flow patroon als een T-175 kolf. Los en verwijder caps. Voeg benodigde hoeveelheid voorverwarmd medium in erlenmeyer met behulp van een 50 of 100 mL pipet of door gieten. Pipetten die ≤ 10 ml kan de bodem van het vat te bereiken wanneer Multi-Kolven worden verticaal geplaatst met dop naar boven. Pipetten ≥ 10 ml direct bereiken in het vat verleden het logo op de Multi-Flask, en bieden zodoende een handig portaal naar grotere volumes van de media van de schepen toe te voegen. Om te voorkomen dat borrelen van medium, laat vloeistofstroom naar flow langs de binnenwand van de Multi-Flask deksel (logo-side). Voeg celsuspensie van een geconcentreerde cel bouillon in groeimedium door de bovenste laag met behulp van een pipet van 10 ml en pet flessen. Tips: – Vervoer Multi-vaten aan een wagen om incubator site en uit te voeren stappen. – De cel zaaien dichtheid zal variëren afhankelijk van het celtype, medium en cultuur duur nodig hebben. Begin met het zaaien dichtheid en de media het volume dat wordt gebruikt in standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5, afhankelijk van de Multi-Flask formaat gebruikt. Het mengen van cellen Mix positie: Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai tegen de klok in een hoek van 45 ° met een mix poort naar u toe. Houden onder dezelfde hoek, zacht Multi-Flask kantelen van voor naar (de hals van je af) terug tot vloeistof in de bovenste laag riool volledig downwards door de mix heen-poort. Pivot op vermengen bakboord. Ook schud Multi-Flask van achter naar voren (de hals naar u toe) tot medium riolering volledig van de onderste laag naar boven door de mix heen-poort. Herhaal de stappen 1.2.2 en 1.2.3 een meer tijd om een ​​goede menging te garanderen. Breng Multi-Flask terug te mengen positie (stap 1.2.1) en ga verder met stap 1.3 Als alternatief kan celsuspensie extern worden bereid uit de Multi-kolf en celsuspensie kan worden toegevoegd aan het schip met behulp van een pipet of door zachtjes te gieten. Mix poort maakt het mogelijk in-vat mengen van cellen met de media en elimineert de noodzaak om extern te maken van grote hoeveelheden celsuspensies. Het maakt het ook mogelijk media-egalisatie over de lagen van de Multi-Flask Evenwicht van vocht Na het mengen / toevoegen van de celsuspensie, te plaatsen Multi-Fles verticaal op een vlakke werkoppervlak gelijk vloeistofvolume vergelijkingenlly in alle lagen. Partitie vloeistof in elke laag Houd de Multi-Flask met het logo naar u toe en draai met de klok mee naar een hoek van 45 ° tot afscherming van de vloeistof in elk van de lagen. Tip: – Voor de beste resultaten, is het belangrijk om een plat werkoppervlak te gebruiken voor Steps 1.3-1.4 Transport Zodra media met celsuspensie is gepartitioneerd, transport Multi-Flask in dezelfde hoek van 45 ° (met de klok mee), zoals in stap 1.4.1 met media uit de buurt van de mix-poort in de incubator. Deze positie is ook geschikt bij het verwijderen van kolven van de incubator voor weergave op een microscoop. Het plaatsen van Multi-Flask op incubator shelf Holding Multi-Flask op de hoek van 45 ° (met de klok mee, weg van de mix-poort), voorzichtig draai het naar beneden horizontaal op de incubator oppervlak (met behulp van de hoek uit de buurt van de mix-poort als eenpivot). Lay Multi-fles met logo naar boven. Falcon Multi-Flask ontwerp maakt het mogelijk schepen te stapelen en houdt ze op zijn plaats door een stevige stapelen rib. Distributie van cellen en reagentia Na het plaatsen van Multi-Flask plat op het werkvlak, zachtjes heen en weer en side-naar rechts gelijkmatig te verdelen cellen op cultuur oppervlakken zorg dat u geen vloeistoffen gemorst van elke laag. Stack kolven. Deze fles is gemaakt van optisch helder materiaal en cellen op de laatste laag kan gemakkelijk worden bekeken op een microscoop. Media-uitwisseling Zuigen, terwijl het kantelen van de Multi-Flask naar links (mix port-zijde) met het logo naar u toe. Vervolgens tilt, de Multi-Flask naar rechts, blijven alle overblijvende media aspireren. Voeg juiste hoeveelheid media en volg de stappen 1.3-1.7 2.Oogsten cellen van Multi-Kolven Aan cellen, line-up Multi-Kolven verticaal dissociëren en brengen elk een stand (stap 1.2.1) Mix. Voorzichtig omdraaien kolven met de hals naar je toe zodat de media drain naar de bovenste laag van de Multi-Flask. Steek een 5 of 10 ml opzuigen tip via de nek tot je vloeistof niveau in de buurt van de mix-poort. Aspiratie uitgeput medium. Voeg dissociatie reagens / wasbuffer en breng aan de positie Mix zoals in stap 1.2.1, ga dan verder en volg de stappen 1.3-1.7. Neutraliseren met groeimedium / neutraliserend agent en giet celsuspensie in een ontvangende buis of omkeren fles zodanig dat cellen drain naar de bovenste laag van het vat en het verzamelen van cellen met behulp van een pipet van 10 ml. Tip: Om herstel van cellen of reagentia te verbeteren, brengen Multi-kolf met positie (stap 1.2.1) mix, omkeren met nek naar de gebruiker om volledige afvoer van materiaal uit al laten l lagen om de bovenste laag. Dan tilt Multi-Flask de klok mee om hoek van 45 ° (weg van de mix-poort), terwijl de Multi-Flask blijft omgekeerd. Gebruik een pipet (1-10 ml) om de resterende reagentia te verzamelen. 3. Aanbevolen werkvolume in Falcon Multi-Kolven Groeimedia 3-laag: 75 tot 150 ml per Multi-Flask 5-laag: 125 tot 250 ml per Multi-Flask Dissociatie-agent 3-Layer: ≥ 15 ml per Multi-Flask 5-Layer: ≥ 25 ml per Multi-Flask Tip: Begin met een gemiddelde volume gebruikt in de standaard T-175 flessen en vermenigvuldig dat met 3 of 5 keer, afhankelijk van de Multi-Flask format geëvalueerd, zodat ml per oppervlakte-eenheid blijft hetzelfde. 4. Representatieve resultaten: 1. Ontwerp van Falcon Multi-Flask files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg "/> . Figuur 1: Multi-Flask Cultuur van de Cel schepen zijn verkrijgbaar in een 3 – en 5-laags stapelbaar formaat voor schaal-up van cellen leveren 525 en 875 cm 2 groei van oppervlakte, respectievelijk. Pipetteer toegang vergemakkelijkt toevoeging en verwijdering van cellen en reagentia in-en uit het vat. Aanwezigheid van mix-poort zorgt voor een snelle in-vat mengen en egalisatie van de media in alle lagen van de Multi-Flask. 2. Celopbrengst met behulp van Multi-Flask: Deze schepen zijn beschikbaar in 3-laags en 5-layer-formaten die overeenkomen met 3 en 5 maal de oppervlakte van de T-175 flessen. Dienovereenkomstig, ≥ 3 en 5 maal (130 ± 6,8 x 10 6 en 218 ± 23,6 x 10 6 cellen, respectievelijk) het aantal BHK-21 (baby hamster nier) cellen werden gekweekt en hersteld van Multi-Flask in vergelijking met T-175 kolven (43,2 ± 3,5 x 10 6 cellen, fig. 2a). Celopbrengst per unit oppervlakte was gelijk in 3 – en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP (menselijke prostaat adenocarcinoma cellijn), Hep-G2 (menselijke levercarcinoom cellijn), EcoPack 2-293 (menselijke nier cellijn) gekweekt voor een periode van 48-96h (Fig.2B) in groeimedia (35 ml per laag), zoals aanbevolen door cel verkoper (ATCC, Sigma en / of Clontech). Cellen werden opgesomd op een geautomatiseerde Vi-CELL teller (1). Figuur 2A: Drie en vijf keer het aantal van de BHK-21 cellen werden gekweekt en hersteld van 3 – en 5-layer Multi-Kolven in vergelijking met T-175 flessen. Verwachte opbrengst werd bepaald met behulp van gemiddelde cel opbrengst van de controle T-175 flessen, vermenigvuldigd met drie en vijf keer voor de 3 – en 5-layer Multi-Kolven respectievelijk (n = 4 kolven / formaat). <br/> Figuur 2B: Cell opbrengst per cm 2 was gelijk in 3 – en 5-layer Multi-Kolven en T-175 flessen voor de BHK-21, LNCaP, HepG2 en EcoPack2-293 cellen. Elke staaf stelt betekenen van 4 tot 6 flessen. BHK-21 cellen (11.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 72 uur, LNCaP cellen (20.000 cells/cm2) en EcoPack2-293-cellen (~ 35.000 cells/cm2) werden gekweekt gedurende 96 uur en HepG2-cellen (25.000 cellen / cm 2 ) werden gekweekt gedurende 48 uur voorafgaand aan de oogst. 3. Media verdeling lagen van Multi-Flask Celcultuur medium (DMEM, Invitrogen) werd toegevoegd aan 5-layer Multi-Kolven (250 mL/5-layer schip) en verdeeld in lagen volgens protocol zoals hierboven beschreven. Mediadistributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en media gepompt uit afzonderlijke lagen. Gewicht van de vloeistof teruggewonnen uit elke laag bleek vrij uniform zijn van laag naar laag zoals getoond in Fig 3. Ze zijn als volgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0.58, 50.21 ± 0.13, 49.88 ± 0.35, 49.45 ± 0.37 (gm). Figuur 3. Uniform mediadistributie in elk van de vijf lagen van een 5-layer Multi-Flask. Celkweekmedium werd toegevoegd aan Multi-Kolven (250 ml/5-layer schip), in evenwicht gebracht en verdeeld aan individuele lagen. De media werd gepompt uit door gaten geboord in de afzonderlijke lagen en vocht gewicht was opgenomen van elke laag (n = 6 flessen). 4. Cell verdeling tussen de lagen van Multi-Flask Cellen kunnen worden toegevoegd en gemengd in de Multi-Flask. We gesimuleerde verdeling van de cellen tussen de lagen van Multi-Flask met behulp van kralen (10μm; Polysciences Inc), vergelijkbaar in grootte aan cellen. Kraal suspensie werd toegevoegd aan Multi-Flask schip met behulp van een 10 ml pipet door de bovenste laag en gemengd met de media in het vat als aflopendribed in het protocol hierboven. Kraal distributie werd gemeten door het boren van gaten in elke laag en vloeistof met kraal suspensie werd gepompt uit afzonderlijke lagen. Bead concentratie hersteld van iedere laag werd gelezen op een Coulter Counter en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3-lagen Multi-Kolven (fig.4a). De mix-poort maakt een homogene verdeling van de cellen en reagentia tussen Multi-Flask lagen. Figuur 4A: Bead distributie in elk van de drie lagen van een 3-laags Multi-Flask. Een suspensie van kralen (3,6 x 10 6 / ml) werd toegevoegd aan medium gedispenseerd in Multi-Kolven (bead schorsing: mediavolume is 1:10, vol: vol) en gemengd, gevolgd door evenwicht en partitie stappen met behulp van de beschreven protocol. Bead concentratie hersteld van elke laag (medium gepompt door de gaten geboord op elke laag) werd gelezen op een Coulter CountER en geregistreerd. Hieronder weergegeven gelijkwaardig zijn inter-layer kraal distributies in 3 – lagen Multi-Kolven (n = 5 flacons) Hieronder volgt zijn representatief beeld van Ecopack 2-293 kleurpatronen van cellen uitgegroeid tot> 80% confluentie op 3-layer Multi-Kolven in groei aangevuld media. Celmonolagen werden gefixeerd en gekleurd met kristalviolet en Multi-Flask lagen werden vervolgens gesneden en afbeeldingen die zijn gescand (2). Let op, cel patroon was homogeen op alle lagen van de Multi-Kolf (Fig.4B). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met meerdere celtypen geëvalueerd (gegevens niet getoond). Figuur 4B: Deze figuur illustreert homogene celgroei tussen de lagen van Multi-kolven. Ecopack-2-293-cellen gegroeid tot> 80% confluentie in 3-lagen Multi-Kolven en T-175 waren gefixeerd en gekleurd met kristalviolet. Multi-Flask schepen werden gesneden en elke gekleurde laag werd gescand. 5 luchttoevoer in Multi-kolf.: Analyse van gebruikte media met BioProfile FLEX analyser (3,4) (Nova Biomedical) van EcoPack2-293 cellen gekweekt gedurende 96 uur lieten geen verschil in de lucht verzadiging van cellen gekweekt in 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen (81,03 ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% omgevingslicht O 2). Figuur 5: Air verzadiging (% ambient O 2) van gebruikte media waren gelijk in de pre-mixed media van 5-layer Multi-Kolven vs T-175 flessen. EcoPack2-293 cellen werden uitgezet met een dichtheid van 35.000 cellen / cm 2 en gekweekt gedurende 96 uur voorafgaand aan de media-analyse (n = 3 flessen).