Внутричерепное имплантация с последующим 3D В Vivo Биолюминесцентный изображений из мышиной глиомы

1. Культуре клеток GL26 клеточная линия была получена из отдела лечения рака и диагностика (DCTD) Национального института рака (NCI), Фредерик, штат Мэриленд. Для облегчения количественного измерения скорости роста опухоли GL261 клетки были сделаны биолюминесцентного использованием Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) с Lenti-X HT Упаковка Mix (Clontech Laboratories, Inc) и FUW- GL плазмиды (щедрый подарок от лаборатории Б. Рубин, MD, PhD). Клетки были сохранены в среднесрочной Дульбеко изменения Орла (DMEM) с 10% тетрациклина без фетальной телячьей сыворотки (FCS; Clontech Laboratories, Inc.) GL261 клетки также стабильно трансфицированных luc2 ген, кодирующий использованием pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] вектор (Promega Corp, Мэдисон, Висконсин) и FuGENE 6 Трансфекция реагента (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) после условий, предусмотренных производителя. Ген luc2 является кодон оптимизированная версия светлячка Люциферасебе, что обеспечивает значительно более высокий световой поток, чем стандартные гена Люк. Стабильный трансфектантов были отобраны и поддерживается в средствах массовой информации DMEM, содержащей 10% FCS и 100 мкг / мл Генетицин (G418, Invitrogen Corp, Карлсбад, Калифорния). До имплантации культивированных клеток собирают по trypsinzation, промывают один раз в DMEM без сыворотки и ресуспендировали в DMEM без сыворотки при концентрации 1 х 10 7 клеток / мл. 2. Хирургия Установка 2 Стерильной среде сохраняется в течение операции, в том числе все хирургические инструменты, расходные материалы, перчатки, шторы и т.д.. Десять неделя C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (альбинос C57BL / 6) мышах закупаются у Национального института рака в Фредерике Программа животноводства и используется в среднем весе 20 граммов (NCI, Фредерик, Мэриленд). Животные наркозом путем внутрибрюшинного введения ксилазина (5 мг / кг), кетамин (50 мг / кг) и бупренорфин (0,05 мг / кг). Кэлектронной щепотку делается для того, что животное является адекватной анестезии, прежде чем операция началась. Движение (даже если небольшая) какой-либо части животного является показателем снижения уровня анестезии. Животное непосредственно дано дополнительное 3,3 мг / кг ксилазина и 26,6 мг / кг кетамина. Температура тела поддерживается использованием лампы и стерильные повязки покрытие тела. Как только животное правильно наркозом, они размещены на мягкой постели из стереотаксической headframe (модель 900 мелких животных стереотаксической, Дэвид Kopf Instruments) [рисунок 1]. Небольшое количество (1 / 4 дюйма) Аква Слезы Мазь смазки Офтальмология применяется более роговицы. Животное закреплены в стереотаксической кадр, открыв рот животного (путем размещения указательным и большим пальцем вокруг челюсти животного) и выдвижной верхней передние зубы в углубление в стереотаксической раме. Зажим затягивается обеспечить голова животного на гарнитуре убедившись, что гоэлектронной голову выравнивается и глаза сосредоточены, убедившись, однако не проявляет чрезмерное силой на голове животного. O 2 шланга вниз выявляется около ноздрей животного. Скорость потока кислорода составляет 0,5 л / мин. Нижней части спины и хвоста выявляется до стереотаксической кровать, стараясь не идти на компромисс дыхания. Места операции разрез выбрит. Povidine-Йод палочки мазков используются для мытья область между глазами возвращаясь к области между ушами с йодом, убедившись, что йод не капать в глаза животного. Клетки готовы к имплантации непосредственно перед операцией и периодически перемешивают до гарантировать, что они не решают. 10 мкл, 50 мм Всемирного Precision Instrument (ИОЦ), Sarasota, FL, шприц с 26 калибр скошенной иглой загружается с клеткой посевной. Если клетки, похоже, собранный вместе в группу может быть необходимо для перезагрузки шприц. 10 мкл шприца помещается в UMP3-1 UltramicroPump микро-инжектор (WPI, Sarasota, FL). 3. Внутричерепное Имплантация 2 Разрез кожи производится с использованием 15 размера лезвие скальпеля и зубчатые щипцы. 10-15 мм разрез делается с продольно между глазами животного, двигаясь в направлении ушей животного подвергая брегмы (стыке сагиттальной и корональной швов в верхней части черепа). Будьте уверены, чтобы правильно определить брегмы для него можно легко спутать с синус области, которая является дистальнее брегмы [Рисунок 2]. После животное седативные он получает внутри разреза инъекции 0,25% (2,5 мг / мл), бупивакаина. Burrhole производится 0,1 мм задняя брегмы и 2,3 мм справа от средней линии на медленно скручивания 16 калибра 1 ½ дюйма иглы стороны, применяя небольшое давление на иглу в то время как скручивание, пока череп проникли и мозг подвергается. Шприц иглой перемещается вниз в положение с помощью Microdrive стеДержатель reotactic шприца, пока она не коснется поверхности мозга. С этой позиции, игла продвигается в мозг на глубину 3 мм и удерживается на месте в течение 3 минут. Игла отозвано 0,4 мм до общей глубиной 2,6 мм под поверхностью мозга, создавая небольшой карман, где клетки должны быть пронизаны. Это не является обязательным в этот момент принять рентгеновского изображения иглы в животных для обеспечения надлежащего размещения и глубины. Клеточной суспензии придают более 3 минут с помощью микро-форсунка установлена ​​в объеме 2000 нл (2 мкл) с инфузии скорость 667 нл / мин. Игла остается на месте в течение 2 минут, чтобы предотвратить утечку от места вливания. Игла медленно сняты полностью. Burrhole наполнен кости воск, используя рассекатель Пенфилд. Разрез зашивается использованием 4-0 (1,5 метрическая система) Викрил шва убедившись, что нет больших пробелов остается в коже. Викрил является шовного материала, которые растворяютсяс, и, следовательно, швы не должны быть удалены, когда разрез исцелились. После операции животные помещены в клетку при нагреве лампа, которая устанавливается на высоте, необходимых для теплой нижней поверхности клетки до 30 ° C. Когда животные полностью проснулся (если судить по нормальному движению в клетке) они возвращаются к жилью группы. Устные ибупрофен добавляется в питьевую воду в течение 5 дней после операции. 100 мг ибупрофена детей (100mg/5ml) добавляется к стандартной 473 мл бутылки воды грызунов. Животные наблюдаются ежедневно и отображаемого и весил каждые 3 дня. Через две недели после имплантации наблюдения увеличивается до двух раз в день. Животные эвтаназии, когда они показывают признаки снижения здоровья, который включает в себя сгорбленная осанка, снижается мобильность и видимой потери массы тела (≥ 20%). Эти симптомы опубликовал ответ на опухоль, и они воспроизводимо появляются примерно за 1 день до смерти из-за опухоли. 4. В естественных условиях </EM> Биолюминесценция изображений 3 Начало [Image Жизнь] программное обеспечение. Система ИВИС изображений инициализируется, нажав [Инициализация ИВИС Система] кнопки на нижней правой части панели управления. Выберите [люминесцентные] Режим изображения в верхней левой части панели управления. Чтобы определить оптимальный момент съемки после инъекции люциферин кинетические исследования необходимо [Рисунок 3]. Это описание для люциферазы светляков; Inject 10 мкл / г веса тела D-люциферин светлячка (15mg/ml в ФБР; Caliper Life Sciences Каталог XR-1001 или аналогичный продукт от другого поставщика) в животное, как описано ниже. Подождите 3 минуты, а затем анестезию мыши, поместив его в газовую камеру анестезии (2% изофлюрана газа в O 2). Выключите газ анестезии, чтобы камеры и открыть клапан анестезии и вакуумный к многообразию ИВИС. Сразу же место седативные животныхна контролируемой температурой платформы визуализации, убедившись, что ноздри мыши правильно помещен в многообразии анестезии газа. Первое изображение должно быть принято примерно через 5 минут после инъекции люциферин. До 5 животные могут быть отображены в одно время в инструменте Спектр ИВИС. Если менее чем за 5 животных для включения в образ, можно подключить неиспользованные многообразие (ы) для сохранения на изофлуран газа. Продолжайте принимать изображения каждые 3 минуты, создавая последовательность до часа, чтобы генерировать кинетической кривой для выражения люциферин. Нажмите на [Setup Sequence] кнопки в панели управления. Последовательность появляется редактор. В панели управления задайте параметры для первой биолюминесцентного изображения в последовательности. Мы рекомендуем начать со средним Биннинг. Мы также рекомендуем Auto-Exposure, чтобы определить оптимальное время воздействия. Выберите [Delay] кнопки в последовательности редакторой указать время задержки в 3 минуты между каждым приобретением. Нажмите кнопку [Добавить] в последовательности редактора. Приобретение параметры затем добавили к столу. Повторите шаг 4 для каждого изображения в последовательности. Как только кривая установлено, оптимальное время визуализации может быть определена путем построения сигнала (интенсивности) в зависимости от времени. Изображение животных в момент самых высоких в естественных условиях фотон счет, чтобы получить сильный и самый точный сигнал. Ранние эксперименты использовали внутрибрюшинного (ф) введение люциферин, однако, ф инъекции иногда в результате прерывистого результаты, показывающие, практически не биолюминесценции в опухоли. Мы предположили, что случайный случайным отсутствие сигнала из-за доставки люциферин для кишечника или других внутренних органов. Поэтому мы стали использовать подкожного (SC) люциферин инъекций и увидел большую воспроизводимость изображений [Рисунок 3]. Двадцатьминут после инъекции подкожно, животных под наркозом, помещая их в камеры с 2% изофлюрана газа в O 2, пока они не будут отвечать на запросы. Анестезии животных (ы) перемещаются в изображения камеры. Офтальмология мази должны использоваться для кинетических исследований из-за длины изображения. Она не нужна для других процедур визуализации, потому что они короткие по продолжительности. Изображения, полученные в среду биннинга с 5 минут времени экспозиции. Опция автоматического приобретения также могут быть использованы. Если сигнал насыщения и / или слабые на средних биннинга, биннинга или время экспозиции может быть скорректирована. Программные файлы и последующие комментарии изображения сохраняются в компьютере каталоге пользователя. 5. 3D изображения 3 Нажмите на [Мастер изображений] вкладке [Setup Sequence] окне панели управления. Выберите [Биолюминесценция] режим получения изображения на экране изображений мастер запуска и CLИк [Далее]. В "биолюминесценции – DLIT" окно визуализации мастера выберите [Firefly] Репортер зонда. Выбросов / возбуждение выбранного спектра источника светлячка появятся шесть соответствующий фильтр выборы должны быть приобретены. Последний появится экран по умолчанию формат, включающий Автоматическая экспозиция приобретение параметров и полевых настроек Посмотреть C. По умолчанию работают очень хорошо, однако эти параметры могут быть изменены при необходимости. Нажмите кнопку [Next] и окно редактора последовательности будет заполняться последовательность шести областях спектра на 20 нм в ширину фильтры (560 нм, 580 нм, 600 нм, 620 нм, 640 нм, 660 нм, а). Нажмите [Приобретать последовательности]. Первый фильтр (560 нм) будет включать в себя структурированную картину светом с помощью лазерного гальванометра установить топографию поверхности. Выберите [Топография поверхности] вкладке палитры инструментов. Поверхность сглаживания может быть применена для учета любых острых углов, созданные во время процесса восстановления.умолчанию низкой сглаживания рекомендуется. Нажмите кнопку [Создать] и окно анализа томографии появится. Нарисуйте рамку кадрирования, что включает в себя весь животный и нажмите кнопку [Далее]. Порог инструмент появится в виде фиолетового маску на выбранной области. Маска должна быть автоматически установлен в соответствии с фотографией животного. Если необходимо, отрегулируйте порог маска более правильно подходят контуры животного. Нажмите кнопку [Готово] и реконструировано сетка появится. Реконструкция может быть сохранен в закладке результатов. После создания рельефа поверхности животного, перейдите к [DLIT 3D-реконструкция] упасть на палитре инструментов. На вкладке [Анализ] выберите вкладку всех шести длинах волн для выполнения реконструкции. Снимите изображения, которые дали насыщенных пикселов или лейкоцитов ниже 600. Оставьте настройки в [Параметры] вкладки по умолчанию. На вкладке [Свойства], "Muscle" должны быть указаны как вариант по умолчанию дляГ тканей Свойства и "Светлячок", должны быть перечислены в качестве источника спектра. Нажмите кнопку [Реконструкция] в закладке Анализ и 3D реконструкции поверхности животного и соответствующая реконструкция источника сигнала должны появиться [Рисунок 4]. Чтобы определить местоположение и интенсивность сигнала, выберите вокселей кнопку на 3D вкладке Инструменты палитры инструментов. Нарисуйте квадрат вокруг все отображается вокселей и измерения общего потока показан в нижней части объема вкладки. Нажмите на [центра масс] для определения сигнала расположение выбранных вокселей. Корональные, сагиттальной и осевая ломтиками животного появятся и используя [Измерение Курсор Display] расстояние от поверхности животного к центру воксела может быть измерена. Пожалуйста, обратитесь к руководству Software живой образ пользователя для получения дополнительной информации о ко-регистрация органа атласы и другие дополнительные возможности. 6. ДанныеНАЛИЗ 3 После изображения приобретается и сохраняется, доступ к программе файл, нажав кнопку [Обзор] кнопку и выбрать файл. Изображение информации можно найти в [Вид] → [Image Information]. Интенсивность сигнала может быть определена количественно путем выбора области интереса (ROI) [ROI Tools] кнопку. Убедитесь, что изображение анализируется в режиме [Фотон], выбрав "Фотон" на раскрывающемся списке в левом верхнем углу панели управления изображением. Выберите [Измерение ROI] кнопку "Тип" в раскрывающемся списке. Выберите ROI форму интересов; варианты включают круг, квадрат, и или Значки. Обложка всех областях интенсивность на полученное изображение. Положение ROI устанавливается путем перетаскивания выбор ROI форме, чтобы область, содержащая биолюминесцентного сигнала. Интенсивности сигнала вычисляется ROI, нажав [меры] кнопку. Этикетке ROI показывает интенсивность. ROI можно управлять и сохранить USIнг программного обеспечения живой образ. 7. Представитель Результаты: Успешная имплантация клетка становится очевидным, когда имплантированные клетки могут быть обнаружены с использованием спектра ИВИС на день операции. Оба GL261-Люк и GL261-luc2 клетки могут быть обнаружены, однако, ген luc2 обеспечит более высокий уровень биолюминесценции [Рисунок 5]. Снимки, сделанные вскоре после имплантации может иметь неспецифический сигнализации на лапах животного и носа, которые должны приниматься во внимание в качестве фона. Сигнал расположен в месте имплантации является реальным и сигнал будет возрастать со временем [Figure 6]. Снижение интенсивности сигнала на 6 день является воспроизводимым и, скорее всего, из-за потери опухоли принять некоторые из имплантированных клеток. Количественные измерения опухолевой массы являются воспроизводимыми в том, что они должны неуклонно увеличиваться, пока в конечном счете, животное погибает от болезни. Тем не менее, кривые роста во многом будет зависеть от состояния имплантированных клеток, и или неизбежных незначительных уаг iability в имплантации. Наша лаборатория избран образ имплантированных животных каждые три дня. Рисунок 1. После мышь должным образом под наркозом, он помещается в стереотаксической раме. Мыши голова крепится с помощью рта зажимом. Рисунок 2. После кожа открыл основные анатомические ориентиры определены в том числе включают брегмы, корональной и сагиттальной швов. Burrhole производится 2,3 мм справа от брегмы медленным скручивания 16 калибра 1 ½ дюйма иглы с небольшим количеством давление, пока череп проникли и мозг подвергается. Рисунок 3. Кинетической сравнение подкожного (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "ALT =" Figure3.1 "/>) по сравнению с внутрибрюшинного ( ) Люциферин инъекция была выполнена, чтобы продемонстрировать полезность подкожного люциферин и определить оптимальное время для изображения после введения люциферин. Через три минуты после люциферин вводили мыши был в отключке, помещается в прибор Спектр ИВИС и отображаемого каждые 3 минуты до часа и каждые 6 минут после этого для получения кинетической кривой биолюминесценции. Это показывает, что подкожно люциферина администрация была выше при введении препарата в наших руках, и что оптимальное время для изображения животных было примерно 25 минут после инъекции люциферин когда GL261-Люк клетки были использованы. Рисунок 4. Множественные виды 3-мерная reconstнагоняй от внутричерепного имплантации GL261-luc2 клетки совместно зарегистрированных скелет мыши и головного мозга. Рисунок 5. Фотон рассчитывает получить от опухолей в результате GL261-Люк клетки против GL261-luc2 клеток. Результаты в среднем на 5 животных. Рисунок 6. График GL261-Люк роста опухолевых клеток в альбиноса C57BL / 6 мышей. Биолюминесценция измеряли каждые 3 дня, а на графике как в естественных условиях по сравнению с фотоном подсчет дней после имплантации. На фотографиях изображены биолюминесценции в различных точках времени. Окраска указанием биолюминесценции (интенсивности пикселей), который является по отношению к опухоли номер ячейки (цветная полоса показано справа). После животное уступил болезни мозга была расчленена и люциферин был добавлен местно для получения бывшим мнимой естественных условияхэлектронной показано на рисунке вставке.