Summary

In vitro Uncoating von HIV-1-Kerne

Published: November 08, 2011
doi:

Summary

Uncoating ist ein wesentlicher Schritt in der frühen Phase der HIV-1 Lebenszyklus und wird als der Demontage der Kapsid-Shell und die Freisetzung des viralen Ribonukleoproteinkomplex (vRNP) definiert. Hier zeigen wir Techniken zur Isolierung von intakten Kernen aus HIV-1 Virionen und zur Quantifizierung ihrer uncoating<em> In-vitro-</em>.

Abstract

Das Genom der Retroviren ist verpackt in einem Kapsid von einer Lipid-Hülle umgeben. Für Lentiviren wie HIV-1, ist die konische Kapsid Schale CA-Protein als ein Gitter aus Sechseck angeordnet sind. Das Kapsid ist um 7 Pentamere auf das breite Ende und 5 am schmalen Ende des Konus 1, 2 geschlossen. Eingeschlossen in diese Kapsid-Shell ist die virale Ribonukleoproteinkomplex, und zusammen umfassen sie den Kern.

Nach der Fusion der Virushülle mit der Zellmembran Ziel ist die HIV-1 in das Zytoplasma freigesetzt. Das Capsid dann zerlegt veröffentlicht kostenlose CA in die lösliche Form 3 in einem Prozess genannt uncoating. Die intrazelluläre Ort und Zeitpunkt des HIV-1 uncoating sind weitgehend unverstanden. Einzel-Aminosäure-Substitutionen in CA, dass die Stabilität des Kapsid verändern ebenfalls beeinträchtigen die Fähigkeit des HIV-1 auf Zellen 4 zu infizieren. Dies deutet darauf hin, dass die Stabilität des Kapsid von entscheidender Bedeutung für HIV-1 Infektion ist. </p>

HIV-1 uncoating wurde schwer Studie aufgrund mangelnder Verfügbarkeit von sensitiven und zuverlässigen Tests für diesen Prozess. Hier beschreiben wir eine quantitative Methode zur Untersuchung uncoating in vitro mit Kernen von infektiösen HIV-1 Partikel isoliert. Der Ansatz beinhaltet Isolierung der Kerne durch Sedimentation von konzentrierten Virionen durch eine Schicht von Wasch-und in eine lineare Saccharose-Gradienten, in der Kälte. Zur Quantifizierung uncoating werden die isolierten Kerne bei 37 ° C für verschiedene Zeitintervalle und anschließend pelletiert durch Ultrazentrifugation. Das Ausmaß der uncoating wird durch die Quantifizierung der Anteil der CA in den Überstand analysiert. Dieser Ansatz wurde eingesetzt, um Effekte von viralen Mutationen auf HIV-1 Capsid Stabilität 4, 5, 6 zu analysieren. Es sollte auch für die Untersuchung der Rolle zellulärer Faktoren in HIV-1 uncoating.

Protocol

1. Produktion von HIV-1 Partikel Bevor Sie fortfahren, müssen Sie eine Genehmigung erhalten und befolgen Sie die Anweisungen aus dem Biosafety Büro Ihrer Institution in einem Biosafety-Anlage für infektiöse HIV genehmigten Arbeitsprogramms. Sie müssen sicherstellen, dass die richtige Pflege und Sicherheitshinweise sind während der Arbeitszeit in der Biosicherheit Labor. Produktion von HIV-1 Partikel ist in der Regel durch transiente Transfektion von 293T-Zell…

Discussion

Die hier beschriebene Methode zur HIV-1-Kerne zu reinigen, um studieren uncoating in vitro ist für das Studium dieser Phase der HIV-1 Lebenszyklus, vor allem aufgrund der Nichtverfügbarkeit eine validierte Methode zur HIV-1 uncoating in Zielzellen zu analysieren nützlich. Obwohl diese Methode verwendet Gleichgewicht Ultrazentrifugation zu Kernen zu reinigen, andere haben direkte Pelletierung nach kurzer Lyse verwendet mit 1% Triton-X-100 12, 13 oder Pelletierung durch eine Saccharose-Kissen mit 0,1% Triton…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HIV-1 uncoating Studien in den Aiken Labor wurden von NIH gewährt AI40364, AI50423 und AI076121 unterstützt. Mehrere wichtige Materialien, einschließlich Reagenzien in der p24 ELISA verwendet wurden, wurden durch die NIH AIDS Research and Reference Program, Division of AIDS, NIAID, NIH zur Verfügung gestellt.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments (optional)
DMEM Cellgro 10-013-CV  
PBS Cellgro 21-031-CV  
Triton-X-100 Mallinckrodt Baker Inc 9002-93-1  
Tween 20 Acros 9005-64-5  
0.25% Trypsin-EDTA Cellgro 25-053-CI  
2XBBS     Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C.
Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537  
Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum)

NIH AIDS Research

and Reference Reagent Program
3957  

Secondary antibody:

Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated
Pierce 31130  
HRP substrate KPL Inc 50-76-11  
Immulon 2HB 96 well plates Thermo Scientific 3455  
SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge Beckman Coulter    
TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter    
High speed microfuge tubes Beckman Coulter 326823, 358123, 357448  
Auto-Densi Flow density gradient fractionator Labconco Corp. 4517000  
Gradient Former CBS Scientific Co. Inc. GM-20  

Referencias

  1. Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
  2. Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
  3. Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
  4. Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
  5. Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
  6. Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
  7. Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
  8. Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. V. . Methods in Molecular Biology. 485, 41-53 (2009).
  9. Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
  10. Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
  11. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
  12. Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
  13. Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
  14. Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
  15. Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).

Play Video

Citar este artículo
Shah, V. B., Aiken, C. In vitro Uncoating of HIV-1 Cores. J. Vis. Exp. (57), e3384, doi:10.3791/3384 (2011).

View Video