Détection multiplex de bactéries dans les échantillons complexes cliniques et environnementaux à l'aide d'oligonucléotides couplés microsphères fluorescentes
Summary
Nous décrivons une méthode multiplex pour la détection des microorganismes dans un échantillon à l'aide d'oligonucléotides couplés billes fluorescentes. Amplicon de tous les organismes au sein d'un échantillon est hybridé à un panel de sondes couplées perles. Un instrument Luminex ou Bio-Plex est utilisé pour interroger chaque perle pour le type de perle et le signal d'hybridation.
Abstract
La vaginose bactérienne (VB) est un syndrome récurrent polymicrobiennes qui se caractérise par un changement dans la «normale» microbiote de Lactobacillus dominé à un microbiote dominé par un certain nombre d'espèces bactériennes, dont Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, et d'autres 1-3. Cette condition est associée à une série de résultats négatifs sur la santé, y compris l'acquisition du VIH 4, et il peut être difficile à gérer sur le plan clinique 5. Par ailleurs, le diagnostic de BV s'est appuyée sur l'utilisation de la coloration de Gram des frottis frottis vaginal qui sont notés sur différents critères numériques 6,7. Bien que ce diagnostic est simple, peu coûteux et bien adapté aux ressources limitées, il peut souffrir de problèmes liés à des interprétations subjectives et il ne donne pas un profil détaillé de la composition du microbiote vaginale 8. Les récents efforts de séquençage en profondeur ont révélé une riche flore vaginale avec diversesdes différences claires entre les échantillons prélevés sur des individus qui sont diagnostiqués avec le BV par rapport à ceux des individus qui sont considérés comme normaux 9,10, ce qui a abouti à l'identification d'un certain nombre de cibles potentielles pour le diagnostic moléculaire de 11,12 BV. Ces études ont fourni une mine d'informations utiles, mais séquençage en profondeur n'est pas encore pratique en tant que méthode de diagnostic dans un contexte clinique. Nous avons récemment décrit une méthode de profilage rapide de la microflore vaginale dans un format multiplex à l'aide d'oligonucléotides couplés avec des billes fluorescentes de détection sur une plate-forme Luminex 13. Cette méthode, comme la coloration de Gram actuelle basée sur les méthodes, est rapide et simple, mais ajoute en outre l'avantage d'exploiter les connaissances moléculaires résultant de séquençage des études en design de la sonde. Cette méthode offre donc un moyen de profil de la micro-organismes importants qui sont présents dans un prélèvement vaginal qui peut être utilisé pour diagnostiquer BV avec une haute spécificité et la sensibilité de compARED à la coloration de Gram tout en fournissant des informations supplémentaires sur la présence et l'abondance d'une façon semi-quantitative et rapide. Cette méthode multiplex est extensible bien au-delà de la gamme des dosages PCR quantitative pour des organismes particuliers, qui est actuellement limitée à 5 ou 6 essais différents dans un seul échantillon 14. Surtout, la méthode n'est pas limité à la détection de bactéries dans des prélèvements vaginaux et peut facilement être adapté rapidement le profil de presque toutes les communautés microbiennes d'intérêt. Par exemple, nous avons récemment commencé à appliquer cette méthodologie à l'élaboration d'outils de diagnostic pour utilisation dans les usines de traitement des eaux usées.
Protocol
Discussion
La spécificité de la génération du signal est d'une importance critique; vous devez être convaincus que le signal observé reflète vraiment la détection de l'amplicon généré par cet organisme. Des logiciels tels que PrimerPlex (Premier Biosoft) peut aider à concevoir des sondes qui vont s'hybrider efficacement, mais ils peuvent ou non croisées s'hybrident à des espèces non ciblées. Lorsque des amorces universelles PCR sont utilisés comme décrit dans ce protocole, il est important de gard…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Alberto Severini et Vanessa Goleski de l'aide pour le développement de tests et de commentaires critiques sur ce manuscrit. Ce travail a été financé par l'Agence de santé publique du Canada et le Programme d'aide la recherche industrielle (Conseil national de recherches du Canada). Un appui supplémentaire a été obtenue à l'Université de la Saskatchewan Fonds de publication.
Materials
| Oligonucleotide name | Company | Sequence1 |
| H279BP | Invitrogen, IDT, or other | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC |
| H280 | YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT | |
| H1612BP | Biotin-OEFOGAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC | |
| H1613 | CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT | |
| 1O, phosphorothioate-C; E, phosphorothioate-G; F, phosphorothioate-A; I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, T or G; S, C or G. | ||
Table 1. Sequences of the modified oligonucleotides for universal cpn60 PCR.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) | Pierce | 22980 | |
| Fluorescent polystyrene beads: MicroPlex Microspheres (Luminex), or Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) | Luminex or Bio-Rad | Bio-Rad: 171-506xxx where xxx corresponds to the bead identifier | Magnetic beads are becoming available for oligonucleotide coupling and may offer certain advantages. Have not been tried by these authors. |
| Capture oligonucleotides (5′ amino C12 modified) | Invitrogen, IDT, or other | various | Desalted purity level is acceptable. Sequences of the capture probes used to characterize vaginal swabs are provided in the manuscript on which this protocol is based13. |
| T7 exonuclease | New England Biolabs | M0263S | |
| Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) | Invitrogen | S-866 | Be careful to obtain high purity SA-PE; this catalog number is recommended |
| Thermowell 96 well PCR plates | Fisher | CS006509 | fit into both 96-well thermocycler and BioPlex machine |
| Thermowell sealing mat | Fisher | CS006555 | Can be re-used; wash with soapy water, rinse well, and dry |
| 5M TMAC | Sigma | T3411 | |
| Bio-Plex or Luminex instrument | Bio-Rad or Luminex | Bio-Rad : 171-000201 | |
| PrimerPlex software for probe design | Premier Biosoft | www.premierbiosoft.com | Suggested for Luminex probe design, although other software platforms may be used |
Table 2. Specific reagents and equipment.
| component | μl/assay | μl/100 assays | final concentration |
| 10x PCR buffer (Invitrogen) | 5 | 500 | 1x |
| 50 mM MgCl2 (Invitrogen) | 2.5 | 250 | 2.5 mM |
| 10 mM dNTP | 1 | 100 | 0.2 mM each |
| H279BP, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1612BP, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| H280, 25 μM | 0.25 | 25 | 375 nM |
| H1613, 25 μM | 0.75 | 75 | 125 nM |
| Water | 34 | 3400 | — |
| Totals | 44.5 | 4450 |
Table 3. Suggested mixtures for PCR with modified cpn60 UT primers (Table 1). The assay is set up for 5 μl of template DNA and 0.5 μl (2.5U) of Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normally large volumes are prepared (e.g. sufficient for 100 assays) and stored at -20°C.
Referencias
- Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. Bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).
- Hay, P. Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot. Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).
- Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. Bacterial vaginosis: a public health review. Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).
- Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women’s susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms. Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).
- Wilson, J. Managing recurrent bacterial vaginosis. Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).
- Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).
- Ison, C. A., Hay, P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).
- Money, D. The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).
- Schellenberg, J. Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).
- Spear, G. T. Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).
- Brotman, R. M., Ravel, J. Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis. Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).
- Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).
- Dumonceaux, T. J. Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres. J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).
- Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics. J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).
- Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization. PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).
- Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. cpnDB: A Chaperonin Sequence Database. Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).
- Bradshaw, C. S. The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy. J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).
- Dumonceaux, T. J. Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target. J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).
