In situ hybridisatie voor de precieze lokalisatie van de transcripten in planten

1. Monstervoorbereiding Let op: Alle stappen tot en met de hybridisatie stap gevoelig zijn voor RNAse activiteit. Het is daarom essentieel om te werken in schone omstandigheden. Het is ook heel gebruikelijk om alle oplossingen te maken RNase-vrij door het gebruik DEPC-behandeld water en glaswerk gebakken op 180 ° C gedurende ten minste drie uur. Plastic containers zijn vaak schoongemaakt door middel van een behandeling met 0,2 N NaOH gedurende 30 minuten. Echter, geen van deze voorzorgsmaatregelen zijn van essentieel belang en wij gewoonlijk gebruik van reguliere schoon milliQ H 2 O voor alle oplossingen. Wij houden afzonderlijke reagentia, dozen en glaswerk voor in situ hybridisaties en bewaar deze in een schone kast. Voorbeeld fixatie Dag 1: Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) fixatief. Voor 500 ml, 400 ml warm 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH7.0) tot 60 ° C en los twee pellets, van NaOH. In een zuurkast, voeg 20 g paraformaldehyde en meng totdat het is opgelost. Zet de oplossing op ijs en wanneer gekoeld op pH 7,2 met H 2 SO 4 (1-2 druppels voor 100ml). En pas het volume tot 500 ml met 1x PBS. Let op: Gebruik geen HCl om de pH aan te passen, aangezien dit zeer giftige dampen vrijkomen. Paraformaldehyde is giftig; deze oplossing moet daarom worden opgesteld in een zuurkast en afgevoerd. Ook is Paraformaldehyde opgeslagen bij 4 ° C en moet worden gekocht nieuwe om de 6 – 9 maanden. Oogst weefselmonsters en onmiddellijk plaats ze in 15 ml verse PFA fixeermiddel op ijs in glazen scintillatieflesjes. Als weefsel dissectie nodig is, is dit het beste gebeuren op het ijs in koude fixeermiddel. Opmerking: Het is belangrijk om een ​​grote hoeveelheid fixatief. De algemene aanbevolen verhouding is tot 10 volumes van fixatief te gebruiken om een ​​volume van weefsel. Breng een vacuüm (~ 500 mm Hg) om de monsters, terwijl op het ijs. Houd een vacuum gedurende 15-20 minuten; kleine belletjes zou moeten bevrijden van het monsters maar het fixeermiddel mag niet komen aan de kook. Langzaam laat de vacuüm en vernieuwen van de PFA fixatief om ervoor te zorgen het fixeermiddel blijft op de juiste concentratie. Herhaal deze stap totdat de weefsels gootsteen na de vrijgave van vacuüm. Let op: Fixatie is vereist om vast te stellen en cross-koppeling RNA-moleculen in het weefsel. Deze stap is cruciaal als slecht vaste materialen leveren een laag signaal. Sommige weefsels niet onmiddellijk zinken, maar de meesten zullen uiteindelijk 's nachts zinken. Ter verbetering van de infiltratie van het fixeermiddel, kunnen de volgende reinigingsmiddelen worden toegevoegd: Triton tot 0,1% en / of Tween tot 0,1 – 0,3%. Als alternatief, ethanol op basis van fixatieven, zoals formaldehyde-alcohol-zuur zuur (FAA), kan worden gebruikt voor weefsels die anders niet gemakkelijk geïnfiltreerd 14,15. Vervang de PFA fixeermiddel eens meer en houd de vaatjes bij 4 ° C gedurende de nacht. Tissue inbedding Dag 2: Pre-cool 1x PBS en de ethanol-serie bij 4 ° C. Spoel de monsters TWIce gedurende 30 minuten elk in 1x PBS, op het ijs. Let op: Ook hier wordt aanbevolen om een ​​grote overmaat aan elke oplossing te gebruiken. Uitdrogen van de monsters door ze door middel van een ethanol-serie, op ijs, als volgt: 10% ethanol 30 min, 30% ethanol 30 min, 50% ethanol 1 uur, 70% ethanol 1 uur, 85% ethanol 1 uur, 95% ethanol een uur, 3 veranderingen van 100% ethanol voor een uur per Aan het eind van de dag, vervang dan de ethanol met 0,1% Eosine in 100% ethanol overnacht bij 4 ° C. Eosine vlekken de celwand waardoor de monsters meer zichtbaar tijdens inbedding en snijden. Opmerkingen: De tijden hier aangegeven zijn geoptimaliseerd voor blokken van 3x3x3 mm, maar langer incubaties nodig kunnen zijn voor grotere monsters. Monsters kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol bij 4 ° C gedurende enkele maanden. </li> Dag 3: De volgende ochtend, de monsters op kamertemperatuur gedurende een uur. Vervolgens geleidelijk vervangen van de ethanol met histoclear als volgt: Aan het eind van de dag, voeg 1 / 4 volume van Paraplast Plus chips en plaats de flacon in een 60 ° C oven. Vul ook een bekerglas met Paraplast chips en vullen dit vaak om vers gesmolten was altijd bij de hand. Let op: De temperatuur van de oven is belangrijk en langdurig verhitten van Paraplast boven 60 ° C moet worden vermeden. Dag 4: Geleidelijk de histoclear met Paraplast te vervangen door het regelmatig toevoegen van meer paraffine chips (ieder uur). Aan het eind van de dag, voorzichtig giet de histoclear / was mengsel en onmiddellijk te vervangen door pure gesmolten was. Laat de monsters bij 60 ° C 's nachts. Dag 5 en 6: dagelijks Wijzig de Paraplast 3 keer, ongeveer om de 4 uur, met vers gesmolten was het houden van de samples bij 60 ° C. Opmerking: Het is mogelijk om de was te veranderen slechts een keer per dag, maar het weefsel voorbereiding zou een paar extra dagen in beslag nemen, zoals de was veranderd moet worden ten minste 5 of 6 keer. Vacuüm infiltratie van de weefselmonsters wanneer deze zich in 100% EtOH en / of in de was kan verdere verbetering van de infiltratie en de inbedding van de weefsels. Vacuüm infiltratie van de monsters in de was moet worden gedaan bij 60 ° C. Dag 7: Verander de was eens te meer. De geur van histoclear moet nu volledig verdwenen en de monsters kunnen later worden ingebed die dag. Het opzetten van een grote opwarming plaat bij 60 ° C beschermd door aluminium folie. De methode van verankering is afhankelijk van het type weefsel te analyseren. Het belangrijkste punt bij deze stap is ervoor te zorgen dat de monsters de juiste richting voor het snijden later. Een manier is het gebruik van plastic mallen en ringen. Warm-up van de schimmels op de opwarming plaat en giet gesmolten was in het onderste deel van de mal. Overdrachteen weefsel monster in de mal met verwarmde pincet op en houd deze in de gewenste positie. Plaats de witte ring op de mal en voeg extra gesmolten was zodanig dat de weefsels volledig worden gedekt. Ga voorzichtig de mal van de plaat naar de bank. Laat de wax langzaam afkoelen. Een andere mogelijkheid is om te verdelen alle monsters in een petrischaal met gesmolten was (de monsters moet volledig worden gedekt door was), terwijl het werken aan de 60 ° C verwarmd bord. Oriënteren de monsters met warme tang. Aan het einde, schakel de plaat. Als de was is gestold, kan het petrischaaltje worden verplaatst naar de bank en dan bewaren bij 4 ° C. Als u klaar bent voor het snijden, kunnen kleine blokken met een weefselmonster worden gesneden uit de petrischaal met een verwarmd mes en gemonteerd op een microtoom preparaathouder met een extra druppel gesmolten was. Laat het monster uitharden een paar minuten voor het snijden. Let op: Blokken kunnenworden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 jaar of langer. Voor meer nuttige tips over het weefsel fixatie en verankering, zie ref. 16 2. Probe voorbereiding Klonen Probes worden meestal gegenereerd om een ​​of meer specifieke gebieden van het gen van belang. Zeer repetitieve sequenties moeten worden uitgesloten van de sonde, maar sequenties die overeenkomen met geconserveerde eiwit-domeinen, zoals DNA-bindende motieven in transcriptiefactoren, meestal levert gen-specifieke expressie patronen 8,9,12,15 (afb. 1). Dit omdat de RNAse A behandeling in de post-hybridisatie stappen (zie hieronder) vermindert het niveau van de probe cross-hybridisatie tussen genen familieleden. RNAse A splitst op mismatches in RNA duplexen, fragmenteren probes gehybridiseerd aan transcripten met onvolmaakte complementariteit, dat zal af worden gewassen in de volgende stappen. In het algemeen kan een aantal probes moeten worden getest voor elk gen van belang. Sondes kunnen worden zo kort als 150 basen lang. Alhoewelh er is geen limiet aan de lengte van de sonde, fragmenten korter dan 1,5 kb typisch transcriberen beter. DNA-fragmenten te transcriberen zijn gekloneerd in een vector die T3, T7 of SP6 promotors (bijv. pCRII-TOPO, Invitrogen). Als alternatief kan T3, T7 of SP6 promoter sequenties worden opgenomen als een 5'-staart op de reverse primer gebruikt voor het versterken van de sonde regio. In elk experiment in situ hybridisatie, nemen we een positieve controle sonde waarvan de hybridisatie patroon bekend is en die consequent werkt, evenals een negatieve controle (Figuur 1D en H). Dit laatste zou een willekeurige RNA probe waarvan bekend is dat niet om te hybridiseren met alle transcripten in het weefsel van belang kan zijn. Hoewel het gebruikelijk om het gevoel van de probe-gen onder analyse, is dit niet nodig en niet-hybridiseren RNA zijn geschikt voor het doel. Indien beschikbaar, zou weefsels uit een transcriptie nul-allel van het gen van belang kan dienen als een uitstekende negatieve controle. <li> In vitro transcriptie Lineariseren het plasmide door het verteren van ongeveer 5 microgram DNA met een restrictie-enzym dat verteert aan het einde van de insert tegenover de site van de promotor. Gebruik geen restrictie-enzymen die een 3'-overhang te verlaten. Dit kan leiden tot transcriptie artefacten, omdat de polymerase kan de 3 'overhang te gebruiken als een substraat om transcriptie te gaan. Als alternatief kan de sonde regio, inclusief de T3, T7 of SP6 promoter worden versterkt door PCR op de DNA-template te genereren voor de in vitro transcriptie reactie. Controleer een hoeveelheid op een gel om te controleren of de reactie is gegaan tot voltooiing. Extract van het DNA met fenol / chloroform, neerslag met ethanol en resuspendeer de DNA pellet in milliQ H 2 O tot een concentratie van 1μg/μl. Als alternatief kan het DNA worden gereinigd met behulp van standaard DNA-zuivering kolommen. Stel de in vitro transcriptie reactie door het mengen van: 1μl purified DNA (1μg/μl) 2μl 10x transcriptie buffer 2 pl 10x DIG RNA etikettering mix 1μl RNAse UIT 2μl T3, T7 of SP6 RNA-polymerase (20 U / pl) H 2 O tot 20μl. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 tot 2 uur. Houden 1μl om later te analyseren op een gel. Let op: Fluorescentie-gelabelde probes hebben de voorkeur in dierlijke systemen, maar vanwege de hoge auto-fluorescentie van de meeste plantenweefsels, In situ hybridisatie protocollen voor het planten te gebruiken radioactief gemerkt sondes 17 of meer algemeen DIG-gelabelde probes die worden gedetecteerd door immunohistochemie. Verwijder de DNA-template door het toevoegen van 75 pi MilliQ H 2 O en 5 ul RQ1 DNAse (1 U / pl) om de transcriptie reactie en het incuberen van de reactie bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Zuiveren de in vitro transcriptie reactie op niet-opgenomen nucleotiden en kleine transcripties te elimineren. Een mogeheid is het gebruik van een grootte-uitsluiting Sephadex ® kolom, zoals de mini-Quick Spin RNA Columns (Roche). Als alternatief kan de transcriptie reactie worden gezuiverd door een conventionele LiCl / ethanol precipitatie (zie ref. 14). Houden 1μl om later te kunnen controleren een gel. Sondes meer dan 250 basen lang zijn meestal gedeeltelijk gehydrolyseerd tot RNA-moleculen van ongeveer 150 nt en dus klein genoeg om efficiënt te dringen het weefsel secties te verkrijgen. Voeg een gelijk volume van 2x carbonaat buffer (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na 2 CO 3) om het gezuiverde transcriptie reactie en incubeer bij 60 ° C. De incubatietijd moet worden berekend door de volgende formule: tijd = (Li – Lf) / (K x Li-x Lf) waar Li = eerste sonde lengte (in kb); Lf = definitieve probe lengte (0.150 kb); K = 0,11 kb / minuut. Houd 2 ui om te controleren op een gel. Neutraliseer de hydrolysereactie door het toevoegen van 1 / 20 volume van 10% azijnzuur. De sonde is dan purigespecificeerd door het toevoegen van 1μl van tRNA (100mg/ml), 1 / 10 volume 3M NaAc pH 5,2, plus 2,5 volumes koude 100% ethanol, en incuberen bij -80 ° C gedurende 30 minuten. Neerslag van de RNA door centrifugeren bij 13.500 rpm gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en spoel de RNA-pellet met 500μl 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw, laat de pellet drogen aan de lucht (meestal ongeveer 15 min), en resuspendeer de RNA in 50μl 50% gedeïoniseerd formamide. De sonde moet worden bewaard bij -80 ° C tot gebruik. Controleren op een regelmatige 1% TAE-agarosegel het uiteindelijke product als intermediaire producten uit punten 2.2.4, 2.2.6 en 2.2.7 (figuur 2A). Dit maakt de controle van de efficiëntie van de in vitro transcriptie reactie. Opmerking: De in vitro transcriptie reactie moet ongeveer 1 ug van RNA opbrengst per 1 ug van de template. Dot Blot-analyse De sonde concentratie en DIG-UTP opname kan worden beoordeeld door de dot-blot-analyse (Figuur 2B). Serial RNA verdunningen zijn gespot op een standaard hybridisatie membraan naast een label controle RNA van bekende concentratie. Zo hebben we gebruik maken van de DIG-gelabelde UTP-controle RNA probe opgenomen in de in vitro transcriptie kit (Roche). Het is het beste om meerdere verdunningen voor elke probe test om een ​​accurate concentratie vast te stellen. Bereid blokkeerbuffer door het oplossen van 0,5% van het blokkeren van reagens in 1x TBS-buffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) bij 70 ° C, dan laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Spot 1μl van seriële verdunningen (meestal 10 -1 tot 10 -5) van de in vitro getranscribeerde en controle probes op een N + nylon membraan. Bevestig de RNA door UV cross-linking. Opmerking: Een minimale oppervlakte van het membraan moet worden gebruikt om het volume van de buffers later nodig te verminderen. Equilibreren het membraan in 1x TBS voor 5 min bij kamertemperatuur (RT) op een platform schudden. Blokkeer het membraan met behulp van de blokkerendebuffer gedurende 30 min bij RT op een platform te schudden. Spoel het membraan in 1x TBS gedurende 5 minuten. Incubeer het membraan met anti-DIG antilichaam, verdunnen 1μl van de Anti-digoxigenine-AP in 10 ml 1x TBS, gedurende 45 min bij RT. Was het membraan tweemaal in 1x TBS voor 15 minuten elk. Equilibreren het membraan in 1x TN-buffer (100mm Tris-HCl pH 9,5, 100mm NaCl) gedurende 5 minuten. Vlekken op de membraan door incubatie met NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) in 1x TN buffer. Vlekken kan 5-10 minuten. Daarna spoel het membraan met water, het kan dan worden gedroogd en bewaard als een record. Let op: NBT / BCIP is een substraat voor het alkalische fosfatase geconjugeerd aan de anti-DIG antistof dat bij hydrolyse levert een donker blauwe kleurstof. 3. Snijden Warm de blokken op kamertemperatuur. Als de blokken zijn te koud is, kan individuele secties te rollen zonder dat de vorming van een wax 'ribbon'. Trim het blok in een trapeZoid vorm waardoor ongeveer 1mm van was rond het monster. Warming-up een grote glijbaan warmer bij 35-37 ° C. Opmerking: Veel protocollen doen dit stap bij 42 ° C maar het verminderen van de temperatuur tot 35-37 ° C voorkomt de vorming van luchtbellen onder de secties. Leg het blok op de microtoom zodanig dat de langste van de twee parallelle vlakken is aan de onderkant. Voorzichtig naar voren te brengen het blok om het mes en zorg ervoor dat het oppervlak van het blok is parallel aan het blad. Sectie op een dikte van 8 – 10μm. De wax linten kunnen worden uitgelijnd op een niet-klevende oppervlak, zoals aluminiumfolie of filtreerpapier, om delen van belang te kiezen. Dit kan worden beoordeeld met behulp van een nabijgelegen dissectie microscoop. Opmerking: De eosine kleuring van het weefsel geeft een indicatie of de weefsels goed zijn geïnfiltreerd in de inbedding. Als het centrum van het blok is niet gekleurd met eosine dit geeft meestal dat het weefsel slecht is verholpen. Mark Probe-on Plus slides met een potlood (de meeste pennen of markers worden gewist tijdens de in situ hybridisatie protocol) en distribueren 1 ml van schone milliQ H 2 O op het. Zorgvuldig zweven delen van de rente op de oppervlakte van het water bij kamertemperatuur (het is gemakkelijker te manipuleren de hoofdstukken over het water bij het werken op kamertemperatuur). Zorg ervoor dat de glimmende kant (de onderkant als het lint komt af van de microtoom) het water gezichten. Dan langzaam overdracht van de schuif naar de dia warmer. Verwarmen helpt de secties verspreid over de oppervlakte van het water. Na 5 minuten, giet het water af voorzichtig, maar in een vloeiende beweging, zodat het lint wordt neergelaten op de dia. Laat de dia's drogen minstens enkele uren of overnacht bij 37 ° C, zodat het weefsel hecht. Let op: doorsnede weefsel kan worden opgeslagen in een doos met silica droogmiddel voor een paar dagen tot weken bij 4 ° C, is het echter het beste om de dia's te gebruiken zo snel mogelijk. 4. In situ Hybridisering Sectie voorbehandeling Het volume voor elke oplossing zal uiteraard afhangen van het aantal dia's te behandelen en de container afmetingen gebruikt. De secties moeten altijd volledig worden ondergedompeld. Voor een 25-glijbaan rack en een keurig passende container, 200-250 ml is voldoende. Omdat veel van de incubatie stappen zijn zeer kort, we meestal bereiden alle mogelijke oplossingen en daarna start de slide pre-behandelingen. Toch zal de azijnzuuranhydride oplossing moet onmiddellijk worden voorbereid voor gebruik en protease wordt toegevoegd op het moment van gebruik. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld. Ook kunnen alle buffers worden voorbereid op 10x concentratie als een stamoplossing. Verwarm de protease-buffer (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) in de container tot 37 ° C. Deparaffinize en hydrateren de weefselcoupes als volgt: histoclear – 10 min (gebruik een glazen schaal) histoclear – 10 min (gebruik eenglazen schaal) 100% ethanol – 1 min 100% ethanol – 30 sec 95% ethanol – 30 sec 85% ethanol – 30 sec 70% ethanol – 30 sec 50% ethanol – 30 sec 30% ethanol – 30 sec 10% ethanol – 30 sec milliQ H 2 O – 1 min Incubeer in 1x PBS gedurende 2 minuten. Mix 625μl van protease 50mg/ml in 250 ml protease buffer voorverwarmd tot 37 ° C en de dia's voor 20 min incuberen bij 37 ° C. Opmerking: De protease is nodig om vast eiwitten verteren en probe toegang tot de cellulaire RNA's te verhogen. Het is van cruciaal belang om de tijd van incubatie controle aan de hybridisatie-signaal te maximaliseren zonder afbraak van het weefsel, waardoor sommige optimalisatie nodig kunnen zijn voor elk weefsel monster. Neutraliseer de protease activiteit in 0,2% glycine in 1x PBS gedurende 2 minuten. Spoel de dia's een keer in 1x PBS gedurende 2 minuten. Behandel de dia's in 4% PFA-oplossing gedurende 10 minuten opnieuw te herstellen van de RNA die zouden kunnen worden beschadigd door de protease behandeling. Twee keer Spoel de dia's in 1x PBS gedurende 2 minuten elk. Terwijl de dia's zijn in het PBS wast, make-up 250 ml van 0,1 M triethanolamine oplossing pH 8.0 door het mengen van 12,5 ml 2M triethanolamine (29.8g in 100 ml milliQ H 2 O, pH8.0 met HCl) in 236.25 ml milliQ H 2 O in een glazen schaaltje. Voeg 1,25 ml azijnzuuranhydride in de triethanolamine buffer onmiddellijk voordat de dia's in, en roer goed. Na het toevoegen van de dia's, langzaam blijven roeren gedurende 10 minuten. Dit vereist dat de dia rack is verhoogd in de container van triëthanolamine / azijnzuuranhydride. We maken gebruik van een klemsysteem met statief. Opmerking: In deze stap, positief geladen aminogroepen die kunnen leiden tot niet-specifieke binding van de probe geacetyleerd zijn. Ook azijnzuuranhydride is giftig; deze oplossing moet daarom worden opgesteld in een zuurkast en afgevoerd <./ Li> Twee keer Spoel de dia's in 1x PBS gedurende 2 minuten. Weer uitdrogen van het weefsel secties: H 2 O – 1 min 10% ethanol – 30 sec 30% ethanol – 30 sec 50% ethanol – 30 sec 70% ethanol – 30 sec 85% ethanol – 30 sec 95% ethanol – 30 sec 100% ethanol – 30 sec 100% ethanol – 30 sec Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen in een container met een kleine hoeveelheid van 100% ethanol op de bodem tot enkele uren bij 4 ° C. Hybridisatie Warm een ​​verwarmingsblok tot 85 ° C. Bereid de hybridisatie buffer. Voor 10 ml, meng in een Falcon tube 1,25 ml in situ hybridisatie zouten (NaCl 3M, 100mm Tris-HCl pH 8,0, 100mm Na Fosfaat pH6.8, 50 mM EDTA), 5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 50% dextransulfaat, 250 ul 50x Denhardt, 125 ul 100mg/ml tRNA, en 875 ul H 2 O. <br /> Let op: dextraansulfaat is erg stroperig, dus het is best de voorverwarming van de oplossing tot 60 ° C te maken pipetteren gemakkelijker te maken. Hybridisatie buffer kan opslaan worden bij -20 ° C. Bereid de verschillende probes. Voor elke dia, meng 1 pi probe met 9 ul milliQ H 2 O en 10 pl gedeïoniseerd formamide. Verwarm de sonde op 85 ° C gedurende 2-3 minuten, onmiddellijk chill op ijs, centrifuge kort en voeg de sonde naar 80μl hybridisatiebuffer per slide. Meng goed door pipetteren, maar voorkomen dat er bubbels. Opmerking: De hoeveelheid sonde moet worden toegevoegd per dia moet empirisch worden getest. Over het algemeen worden probes gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0,5 ng / kb / ul sonde complexiteit. Omdat hybridisaties worden uitgevoerd met 100 ul per slide, is ongeveer 25 ng van de sonde die nodig zijn per dia voor de probes die zijn 0,5-kb in lengte en 50 ng van de sonde per dia voor probes die zijn 1-kb lang. Voor de eenvoud hebben we vaak proberen 0,5, 1 en 4 pi probe per slide. Plaats de dia's op eenschoon oppervlak en laat ze de lucht drogen gedurende 5-10 minuten. Pipet de sonde / hybridisatiebuffer mix op de rechterkant van de dia. Geleidelijk te verlagen een dekglaasje op de foto, zorg ervoor dat de hybridisatie-oplossing alle onderdelen omvat, zonder enige luchtbellen. Zachtjes tik op het dekglaasje met je vinger waar bubbels vormen om ze te verdringen van alle weefselcoupes. Trek niet aan het deksel glijden, omdat dit schade aan de secties. Opmerking: Een alternatieve methode gebruikt voor deze stap is de voorbereiding "broodjes" van twee dia's die worden geïncubeerd met dezelfde sonde. Voor meer details over deze methode, zie ref. 14. Bereid een luchtvochtigheid kamer in een perfect vlakke plastic doos. Bedek de bodem van de doos met Whatman papier bevochtigd met milliQ water, bedekt u het papier met parafilm het verlaten van de hoeken onbedekt, plaats de dia's in de plastic doos en strak zegel van de doos. Incubeer de glaasjes op de gewenste hybridisatie temperatuur, meestal 50 – 55 ° C, fof 16-20 uur. Voor het gebruik van de volgende ochtend, voor te bereiden 1 liter 0,2 x SSC en slaat deze op 55 ° C. Daarnaast bereiden 1 liter NTE buffer (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA pH8.0) en sla bij 37 ° C. Post-hybridisatie behandeling Verwijder voorzichtig de dekglaasjes om geen schade aan de secties. Plaats de dia's in een rek en twee keer was ze in 0,2 x SSC bij 55 ° C gedurende een uur. Let op: Dekglaasjes vaak gemakkelijk vallen wanneer de dia's worden rechtop geplaatst. Als het dekglaasje blijft aangesloten, dompel de dia in warme 0,2 x SSC voor 1 of 2 minuten naar het dekglaasje wassen. Trek het dekglaasje van de dia, want dit kan schade aan de secties te veroorzaken. In de tussentijd bereiden 500 ml wasbuffer (1% BSA, 0,3% Triton in TBS buffer) en 100 ml blokkeren oplossing (0,5% blokkeren van reagens in TBS-buffer). Roer het blokkeren poeder in TBS dat langzaam wordt verwarmd tot 70 ° C en laat het afkoelen tot kamertemperatuur eens dissolved. Opmerking: De volumes van was-buffer en het blokkeren die nodig zijn oplossing zal variëren afhankelijk van de grootte van de platte plastic box worden gebruikt in stappen 4.3.8 -11. Het zal enige tijd duren om volledig op te lossen Triton, dus bereid voldoende oplossing op voorhand. Evenwicht van de dia's in 1x NTE gedurende 2 minuten. Ga verder naar de RNAse A behandeling door het overbrengen van de dia's in 1x NTE buffer waarop 20μg/ml RNAse A wordt toegevoegd vlak voor gebruik, incuberen bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Let op: RNAse A splitst gratis single-stranded RNA alsmede op verschillen in de RNA duplexen. Deze stap helpt het niveau van de niet-specifieke binding van de probe, zoals gesplitst probed fragmenten worden afgewassen in de laatste 0,2 x SSC gewassen (zie 4.3.6). Twee keer Spoel de dia's in 1x NTE gedurende 2 minuten elk. Was de dia's in verse 0,2 x SSC bij 55 ° C gedurende een uur. Evenwicht van de dia's in 1x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Overdracht van de dia's uit het rek op ee bodem van een platte plastic doos en bedek ze met een minimaal volume van het blokkeren oplossing. Blokkeer de dia's voor 45 min op een langzaam schudden platform. Overdracht van de dia's om een ​​tweede schone platte plastic doos en was ze gedurende 45 min met wasbuffer op een platform te schudden. Ga verder met het antilichaam incubatie. Verdun de anti-digoxigenine antilichaam in wasbuffer (1:5 v / v) en ofwel rechtstreeks van toepassing een minimaal volume op elke dia of plaats de dia in een platte plastic doos en bedek ze met een minimaal volume antilichaam oplossing. Incubeer de glaasjes in het donker gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Was de dia's vier keer voor 15 minuten elk met wasbuffer bij schudden platform. Gebruik een minimaal volume van de wasbuffer en een platte plastic doos. Reinig de plastic doos tussen elk van de wasbeurten. Let op: Het reinigen van de box tussen de wasbeurten zal verminderde de algemene achtergrond van de dia. Ter vereenvoudiging van dit maken we gebruik van twee identieke platte dozenen de overdracht van de dia's in een schone doos na elke wasbeurt. Breng de dia's in 1x TBS gedurende 2 minuten. Twee keer equilibreren de dia's in TN-buffer gedurende 2 minuten elk. Bereid kleuroplossing direct voor het gebruik door de toevoeging van 20 ul NBT / BCIP per 1 ml TN-buffer. Giet de kleuroplossing in een kleine plastic droogschaal. Sandwich twee dia's, samen met de delen naar elkaar toe. Dip een lange zijde van de sandwich in de oplossing, zodat capillaire werking op te trekken van de oplossing. Giet de dia's op een Kimwipe en vul de dia's met antilichaam-oplossing weer. Mogelijk moet u de dia's tikken als de oplossing stromen in om luchtbellen te vermijden. Plaats de dia's in een plastic doos en bewaar bij kamertemperatuur in het donker. Dag 10 tot dag 15: vernieuwen van de kleuroplossing tweemaal daags gedurende 1-5 dagen door het spoelen van de dia's in TN-buffer en het opstellen van nieuwe broodjes met vers kleuroplossing. Let op: Het vervangen van de kleuroplossing regelmatig intervals verbetert het signaal naar achtergrond ratio. Ontwikkeling van het signaal kan worden gevolgd onder een verbinding of stereo-microscoop. Het is mogelijk om te fotograferen de secties, terwijl ze in TN-buffer tussen de rondes van vlekken of nadat ze zijn overgebracht naar het water net voor permanente montage. Montage Zodra het signaal is duidelijk, spoelt u de dia's in milliQ H 2 O en snel uitdrogen ze door een ethanol-serie: 10% ethanol – 10 s 30% ethanol – 10 s 50% ethanol – 10 s 70% ethanol – 5 s 80% ethanol – 5 s 95% ethanol – 5 s 100% ethanol – 5 s histoclear – 2 min histoclear – 2 min Opmerking: Zorg ervoor om elk van deze incubatietijden kort te houden, omdat het signaal is ethanol oplosbaar. Monteer de dia's door het plaatsen van een of twee druppels op basis van tolueen montage medium op elkaar geschovene en langzaam het verlagen van de dekglaasje op de glijbaan het vermijden van de vorming van bubbels. Laat de montage medium harden 's nachts voor het analyseren van het resultaat van een samengestelde microscoop. Eenmaal gemonteerd, kunnen dia's worden opgeslagen voor jaren bij kamertemperatuur. 5. Representatieve resultaten: Na 1-5 dagen zal er een rood-paars-signaal te ontwikkelen in die cellen waar de sonde gehybridiseerd met complementair transcripten (figuur 1). De kleur signaal geeft dus een directe visualisatie op cellulair resolutie van het expressiepatroon van het gen van belang. Een zwakkere achtergrondkleuring kan ook de ontwikkeling, als gevolg van de niet-specifieke binding van de probe of vlekken van de plant weefsels (figuur 3). Een dergelijke achtergrond signaal kan relatief meer uitgesproken zijn in de kleine, minder bepaald cellen van het weefsel, maar achtergrondkleuring zou ook worden waargenomen in delen gehybridiseerd met de negatieve en positieve controle probes en zouden nietworden reproduceerbare tussen de experimenten. Figuur 1. Representatieve resultaten verkregen met verschillende sondes op Arabidopsis en maïs weefsels. In situ hybridizaties van Arabidopsis (AD) en maïs (EH) weefsels met verschillende gen-specifieke probes ter illustratie van de aard van de resultaten die kunnen worden verwacht op de succesvolle afronding van de geschetste protocol. (A) Lokalisatie van SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) in het Arabidopsis vegetatieve shoot top, let op de aanwezigheid van paars blauw signaal in de onbepaalde cellen van het meristeem en het gebrek aan signaal in de omringende bladeren. (BD) Delen van Arabidopsis torpedo stadium embryo's laten zien CLAVATA3 (B) expressie in de paar embryonale stamcellen, AtML1 (C) tot uitdrukking in de epidermale laag, en het ontbreken van een signaal in de artikelen gemerkt met een willekeurige negatieve controle RNA (D). (E) lokalisatie van de STM-homoloog knotted1 in de zich ontwikkelende embryo maïs, let op de sterk signaal met name in de embryonale meristeem en de wortel. (FH) Longitudinale secties door het vegetatieve schieten apex van maïs met verschillende in situ hybridisatie patronen voor arf3a (F) en ocl4 (G) en geen hybridisatie signaal voor de negatieve controle sonde (H). arf3a komt op het abaxiale / onderste blad oppervlak, terwijl de AtML1 homoloog ocl4 is specifiek tot expressie gebracht in de epidermis. De volgende genfragmenten werden gebruikt als probe: STM: de cDNA regio omvattende aminozuren 81 tot 382, die de geconserveerde homeodomein omvat; CLV3: de volledige lengte cDNA, AtML1: de derde exon, KN1: de gehele open reading frame; arf3a: nucleotiden 9-225 van de cDNA-kloon HM004539, ocl4: de drie '1,7 kb van de volledige lengte cDNA, waarin verschillende geconserveerde eiwit-domeinen omvat. <p class = "jove_content"> Figuur 2. Controle punten tijdens het maken van in vitro transcriptie sondes. (A) In situ hybridisatie probes worden gecontroleerd op een standaard agarosegel na in vitro transcriptie (een), na DNase behandeling en daaropvolgende zuivering van de in vitro transcriptie reactie (b), na hydrolyse carbonaat-indien nodig-(c) en wanneer klaar voor gebruik (d). Voor de sondes meer dan 250 bp in lengte, zoals een probe, zal het carbonaat hydrolyse een reeks van kleinere probe fragmenten (beugel). (B) Colorimetrische kwantificering van sondes door de dot-blot-analyse. Verdunningen, variërend van 10 -1 tot 10 -5 van een 100 ng / ul control sonde (1) en van de drie nieuw DIG-gelabelde probes (2-4) zijn gespot op een transfer membraan geïncubeerd met anti-DIG antilichaam, en getest het gebruik van de colorimetrische assay beschreven in paragraaf 2.3 van het protocol. De analyse suggereertde volgende geschatte concentraties: sonde 2, ~ 100 ng / ul, sonde 3, ~ 10 ng / ul sonde 4, ~ 1 ng / ul. Probe 4 is het onwaarschijnlijk dat een goed rendement in situ hybridisatie signaal. Figuur 3. Vergelijking van een niet-specifieke sonde naar een goed werkende sonde. Longitudinale secties door het vegetatieve shoot top uit maïs met een niet-specifieke achtergrond signaal (A) en een specifieke in situ hybridisatie signaal voor de OCL5 sonde in de buitenste cellaag (B). Figuur 4. Schematische weergave van de tijdlijn van de stappen in de in situ hybridisatie protocol. Tissue inbedding stappen zijn aangegeven in groen, probe-voorbereiding stappen in oranje, en de in situ hybridisatie stappen in het blauw. Deze tijdlijn is van mening dat de DNA Template voor de in vitro transcriptie van de sonde is beschikbaar. Petroleum-ingebed weefsel blokken en DIG-gelabelde probes kan vooraf worden bereid en opgeslagen bij 4 ° C en -80 ° C, respectievelijk tot het moment van gebruik. De in situ hybridisatie protocol kan dan worden afgerond in slechts vier dagen.