In-situ-Hybridisierung für die genaue Lokalisierung der Transkripte in Pflanzen

1. Probenvorbereitung Hinweis: Alle Schritte bis einschließlich der Hybridisierung sind empfindlich gegen RNAse Aktivität. Es ist daher wichtig, in sauberen Bedingungen arbeiten. Es ist auch durchaus üblich, um alle Lösungen RNase-frei zu machen, indem Sie DEPC-behandeltem Wasser und Gläser bei 180 ° C für mindestens 3 Stunden. Behälter aus Kunststoff werden häufig durch Behandlung mit 0,2 N NaOH für 30 min gereinigt. Allerdings sind keine dieser Vorsichtsmaßnahmen wichtig, und wir verwenden in der Regel regelmäßige Reinigung milliQ H 2 O für alle Lösungen. Wir haben getrennte Reagenzien, Dosen und Gläser für in situ Hybridisierungen zu halten und speichern diese in einem sauberen Schrank. Beispiel Fixierung Tag 1: Bereiten Sie frischen 4% Paraformaldehyd (PFA) Fixativ. Für 500 ml, 400 ml warmem 1x PBS (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4 pH 7,0) auf 60 ° C und lösen sich zwei Tabletten mit NaOH. In einer Abzugshaube, fügen Sie 20 g paraformaldehyde und gründlich mischen, bis es gelöst. Legen Sie die Lösung auf Eis und beim Abkühlen der pH-Wert auf 7,2 mit H 2 SO 4 (1-2 Tropfen für 100ml). Dann stellen Sie die Lautstärke auf 500 ml mit 1x PBS. Hinweis: Verwenden Sie keine HCl zur Einstellung des pH wie diese hochgiftigen Dämpfe freisetzen wird. Paraformaldehyd ist giftig; dieser Lösung sollte daher in einem Abzug vorbereitet und ordnungsgemäß entsorgt werden. Außerdem ist Paraformaldehyd bei 4 ° C gelagert und sollte neu gekauft werden alle 6 – 9 Monate. Ernte-Gewebeproben und legen Sie sie sofort in 15 mL frisches PFA Fixativ auf Eis in Glasszintillationsröhrchen. Wenn Gewebedissektion erforderlich ist, wird dies am besten auf Eis in kaltem Fixativ getan. Hinweis: Es ist wichtig, ein großer Überschuss an Fixativ verwenden. Die allgemeine empfohlene Verhältnis ist auf 10 Bände Fixativ zu 1 Volumen von Gewebe verwendet werden. Anwenden eines Vakuums (~ 500 mm Hg), um die Proben, während auf dem Eis. Halten Sie ein Vakuum für 15-20 Minuten, kleine Bläschen sollten aus der Probe Releases, aber das Fixativ sollte nicht zum Kochen kommen. Lassen Sie die Vakuum langsam, und erneuere das PFA Fixativ, um sicherzustellen, das Fixiermittel bleibt in der richtigen Konzentration. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis das Gewebe nach der Entlassung von Vakuum zu versenken. Hinweis: Fixation ist erforderlich, um fix und Cross-Link-RNA-Moleküle im Gewebe. Dieser Schritt ist wichtig, wie schlecht festen Materialien ergeben ein Low-Signal. Einige Gewebe nicht sofort sinken, aber die meisten werden schließlich über Nacht zu versenken. Zur Verbesserung der Infiltration der Fixateur, können die folgenden Waschmitteln zugesetzt werden: Triton bis zu 0,1% und / oder Tween bis zu 0,1 bis 0,3%. Alternativ Ethanol-basierte Fixiermittel, wie Formaldehyd-Alkohol-Essigsäure (FAA), kann für Gewebe, die sonst nicht so leicht 14,15 infiltriert werden. Ersetzen Sie die PFA Fixativ noch einmal und halten Sie die Fläschchen bei 4 ° C über Nacht. Tissue Einbettung Tag 2: Pre-cool 1x PBS und das Ethanol-Reihe bei 4 ° C. Spülen Sie die Proben twice je 30 min in 1x PBS, auf Eis. Hinweis: Auch hier empfiehlt es sich, ein großer Überschuss an jede Lösung verwenden. Entwässern der Proben, indem sie durch eine Ethanol-Serie, auf Eis, wie folgt: 10% Ethanol 30 min, 30% Ethanol 30 min, 50% Ethanol 1 Stunde, 70% Ethanol 1 Stunde, 85% Ethanol 1 Stunde, 95% Ethanol 1 Stunde, 3 Wechsel von 100% Ethanol für 1 Stunde pro Am Ende des Tages, ersetzen Sie das Ethanol um 0,1% Eosin in 100% Ethanol über Nacht bei 4 ° C. Eosin färbt die Zellwand macht die Proben besser sichtbar beim Einbetten und Schneiden. Hinweise: Die angegebenen Zeiten hier für Blöcke von 3x3x3 mm, aber mehr Inkubationen können für größere Proben erforderlich optimiert. Die Proben können in 70% Ethanol bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert. </li> Tag 3: Am nächsten Morgen, warm die Proben auf Raumtemperatur für eine Stunde. Dann ersetzen Sie das Ethanol nach und nach mit histoclear wie folgt: Am Ende des Tages, fügen Sie 1 / 4 Volumen von Paraplast Plus-Chips und die Küvette in einem 60 ° C im Ofen. Auch füllen ein Becherglas mit Paraplast Chips und ergänzen dies häufig, um immer frisch geschmolzenem Wachs auf der Hand. Hinweis: Die Temperatur des Ofens ist wichtig und längeres Erhitzen von Paraplast über 60 ° C sollten vermieden werden. Tag 4: Nach und nach ersetzen histoclear mit Paraplast durch regelmäßige Zugabe von mehr Paraffin-Chips (jede Stunde). Am Ende des Tages, sorgfältig abgießen histoclear / Wachs-Mischung und sofort ersetzen Sie es mit reinem geschmolzenem Wachs. Lassen Sie die Proben bei 60 ° C über Nacht. Tage 5 und 6: Ändern Sie die Paraplast 3-mal täglich, ca. alle 4 Stunden, mit frischen geschmolzenes Wachs halten die sBeispiele bei 60 ° C. Hinweis: Es ist möglich, um das Wachs nur einmal zu ändern am Tag, aber das Gewebe Vorbereitung dauern würde, ein paar zusätzliche Tage in Anspruch nehmen, da das Wachs muss geändert mindestens 5 oder 6 mal sein. Vakuuminfiltration der Gewebeproben, wenn diese in 100% EtOH und / oder in Wachs sind, können weitere Verbesserung der Infiltration und Einbettung von Gewebe. Vacuum Infiltration von Proben in Wachs sollte bei 60 ° C durchgeführt werden Tag 7: Ändern Sie das Wachs wieder. Der Geruch von histoclear sollte nun vollständig verschwunden sein und die Proben können später eingebettet werden an diesem Tag. Richten Sie eine große Warmhalteplatte bei 60 ° C mit Aluminiumfolie geschützt. Die Methode der Einbettung ist abhängig von der Art des Gewebes untersucht werden. Der wichtigste Punkt bei diesem Schritt ist es, sicherzustellen, dass die Proben korrekt sind zum Schneiden später orientiert. Eine Möglichkeit ist, Kunststoffformen und Ringe verwenden. Warm up der Formen auf der Warmhalteplatte und gießen geschmolzene Wachs in den unteren Teil der Form. Transfereiner Gewebeprobe in die Form mit einer Pinzette erwärmt und richten Sie ihn in die gewünschte Position. Setzen Sie den weißen Ring auf die Form und fügen Sie zusätzliche geschmolzenes Wachs, so dass das Gewebe vollständig bedeckt sind. Bringen Sie den Schimmel von der Platte auf der Bank. Lassen Sie das Wachs abkühlen allmählich. Eine andere Möglichkeit ist es, alle Proben in einer Petrischale mit geschmolzenem Wachs (die Proben vollständig mit Wachs abgedeckt werden) während der Arbeit an den 60 ° C erwärmt Platte verteilen. Richten Sie die Proben mit warmen Pinzette. Am Ende, schalten Sie die Platte. Wenn das Wachs erstarrt ist, kann der Petrischale auf die Bank verschoben werden und dann bei 4 ° C lagern Wenn Sie bereit sind für das Schneiden, können kleine Blöcke mit einer Gewebeprobe aus der Petrischale geschnitten werden mit einem angewärmten Messer und montiert auf einem Mikrotom Probenhalter mit einem zusätzlichen Tropfen geschmolzenen Wachs. Lassen Sie die Probe hart für ein paar Minuten vor dem Schneiden. Hinweis: Blöcke könnenbei 4 ° C gelagert werden für 1 Jahr oder länger. Weitere hilfreiche Tipps Gewebe Fixierung und Einbettung, vgl. Rz. 16 2. Probe Vorbereitung Cloning Sonden werden in der Regel auf eine oder mehrere bestimmte Regionen des Gens von Interesse. Hoch repetitive Sequenzen sollten von der Sonde ausgeschlossen werden, sondern Sequenzen, die aus konservierten Protein-Domänen, wie zB DNA-bindenden Motive in Transkriptionsfaktoren, in der Regel erbringt Gen-spezifische Expressionsmuster 8,9,12,15 (Abb. 1). Dies, weil die RNAse Eine Behandlung in der post-Hybridisierung Schritte (siehe unten) reduziert die Höhe der Sonde Kreuzhybridisierung zwischen Gen-Familienmitglieder. RNAse A spaltet bei Fehlanpassungen in RNA-Doppelstränge, Fragmentierung Sonden hybridisiert, um Transkripte mit unvollkommenen Komplementarität, die off in den nachfolgenden Schritten wird gewaschen werden. Im Allgemeinen können mehrere Sonden müssen für jedes Gen von Interesse getestet werden. Probes können so kurz wie 150 Basen Länge. Although gibt es keine Begrenzung für die Länge der Sonde, Fragmente kürzer als 1,5 kb in der Regel zu transkribieren besser. DNA-Fragmente transkribiert werden in einen Vektor, T3, T7 oder SP6-Promotoren (z. B. pCRII-TOPO, Invitrogen) kloniert. Alternativ können T3, T7 oder SP6-Promotor-Sequenzen als 5'-Schwanz auf dem Reverse-Primer zur Amplifikation der Sonde Region genutzt werden. In jedem in-situ-Hybridisierung Experiment, schließen wir eine positive Kontrolle Sonde für die Hybridisierung Muster bekannt ist und welche Werke konsequent, als auch eine negative Kontrolle (Abbildung 1D und H). Letzteres könnte eine zufällige RNA-Sonde, die bekanntermaßen nicht zu jedem Transkripte in das Gewebe von Interesse hybridisieren wird. Obwohl es üblich ist, die sense-Sonde des Gens unter Analyse zu verwenden, ist dies nicht notwendig und eine nicht-hybridisierende RNA wird dem Zweck entsprechen. Falls vorhanden, würde Gewebe aus einem Transkriptions-Null-Allel des Gens von Interesse, wie eine exzellente Negativ-Kontrolle dienen. <li> In-vitro-Transkription Linearisierung des Plasmids durch Aufschließen von ca. 5 pg DNA mit einem Restriktionsenzym, dass am Ende des Einsatzes gegenüber der Website des Veranstalters verdaut. Verwenden Sie keine Restriktionsenzyme, die eine 3'-Überhang zu verlassen. Dies kann zu Artefakten führen, da die Transkription der Polymerase kann die 3-Überhang als Substrat verwenden, um die Transkription fortgesetzt werden. Alternativ kann die Sonde Region einschließlich der T3, T7 oder SP6-Promotor durch PCR amplifiziert werden, um die DNA-Matrize für die In-vitro-Transkriptions-Reaktion zu erzeugen. Bitte ein Aliquot auf einem Gel zu überprüfen, ob die Reaktion vollständig abgelaufen war. Extrahieren Sie die DNA mit Phenol / Chloroform, Niederschlag mit Ethanol und resuspendieren der DNA-Pellet in milliQ H 2 O zu einer Konzentration von 1μg/μl. Alternativ kann die DNA gereinigt mit Standard-DNA-Aufreinigung Spalten. Richten Sie die In-vitro-Transkriptions-Reaktion durch Mischen: 1μl punigten DNA (1μg/μl) 2μl 10x Transkriptionspuffer 2 ul 10x DIG RNA Labeling Mix 1μl RNAse OUT 2μl T3, T7 oder SP6 RNA-Polymerase (20 U / ul) H 2 O bis zu 20 &mgr; l. Bei 37 ° C für 1 bis 2 Stunden. Keep 1μl auf ein Gel später zu analysieren. Hinweis: Die Fluoreszenz-markierten Sonden sind in tierischen Systemen bevorzugt, aber aufgrund der hohen Autofluoreszenz der meisten pflanzlichen Geweben, In-situ-Hybridisierung Protokolle für Pflanzen verwenden radioaktiv markierten Sonden 17 oder häufiger DIG-markierten Sonden, die durch Immunhistochemie nachgewiesen werden. Entfernen Sie die Template-DNA durch Zugabe von 75 ul MilliQ H 2 O und 5 ul RQ1 DNAse (1 U / ul), die Transkription und Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 10 min. Purify die in vitro Transkription Reaktion auf nicht-eingebaute Nukleotide und kleine Transkripte zu beseitigen. Eine Möglichkeitkeit ist es, ein Ausschluss-Sephadex ®-Säule, wie die Mini Quick Spin RNA Columns (Roche) verwendet werden. Alternativ kann die Transkription von einem herkömmlichen LiCl / Ethanol-Fällung (vgl. Rz. 14) gereinigt werden. Keep 1μl auf ein Gel später zu überprüfen. Probes über 250 Basen lang sind in der Regel teilweise hydrolysiert, um RNA-Moleküle von ca. 150 nt und damit klein genug, um effizient in das Gewebe eindringen Abschnitte zu erhalten. Fügen Sie dem gleichen Volumen 2x Carbonat-Puffer (80 mM NaHCO 3, 120 mM Na 2 CO 3), um das gereinigte Transkriptionsreaktion und inkubieren bei 60 ° C. Die Inkubationszeit sollte nach folgender Formel berechnet werden: Zeit = (Li – Lf) / (K x Li x Lf) wo Li = initial Sondenlänge (in kb); Lf = endgültige Sondenlänge (0,150 kb); K = 0,11 kb / Minute. Halten Sie 2 ul auf einem Gel zu überprüfen. Neutralisieren der Hydrolyse Reaktion durch Zugabe von 1 / 20 Volumen von 10% Essigsäure. Die Sonde wird dann puriFied indem 1μl der tRNA (100mg/ml), 1 / 10 Volumen 3M NaAc pH 5,2, plus 2,5 Volumen kaltem 100% Ethanol und Inkubation bei -80 ° C für 30 min. Fällung der RNA durch Zentrifugation bei 13.500 rpm für 20 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und spülen Sie das RNA-Pellet mit 500μl 70% Ethanol. Centrifuge wieder, lass das Pellet an der Luft trocknen (typischerweise etwa 15 min) und Resuspension der RNA in 50 ul 50% deionisiertem Formamid. Die Sonde sollte bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Überprüfen Sie in regelmäßigen 1% TAE-Agarosegel das Endprodukt sowie Zwischenprodukte aus den Abschnitten 2.2.4, 2.2.6 und 2.2.7 (Abbildung 2A). Dies ermöglicht die Überwachung der Effizienz der in vitro Transkription. Hinweis: Die in-vitro-Transkriptions-Reaktion sollte etwa 1 ug RNA pro 1 pg Vorlage liefern. Dot-Blot-Analyse Die Sonde Konzentration und DIG-UTP Einarbeitung kann durch Dot-Blot-Analyse (Abbildung 2B) beurteilt werden. Serielle RNA Verdünnungen werden auf einem Standard-Hybridisierungsmembran neben einer markierten Kontroll-RNA bekannter Konzentration entdeckt. Zum Beispiel verwenden wir das DIG-UTP markierten Kontroll-RNA-Sonde in der in vitro-Transkription-Kit (Roche) enthalten. Am besten ist es, mehrere Verdünnungen für jede Probe-Test, um eine genaue Konzentration zu etablieren. Bereiten Blockierungspuffer durch Auflösen von 0,5% Blockierungsreagenz in 1x TBS-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) bei 70 ° C, dann lassen Sie die Lösung abkühlen auf Raumtemperatur. Spot 1μl von Verdünnungsreihen (typischerweise 10 -1 bis 10 -5) der in vitro transkribiert und Kontrolle Sonden auf einem N + Nylonmembran. Fix die RNA durch UV-Vernetzung. Hinweis: Eine minimale Oberfläche der Membran sollte verwendet werden, um das Volumen der Puffer benötigt später zu reduzieren. Äquilibrieren Sie die Membran in 1x TBS für 5 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Schütteltisch. Blockieren Sie die Membran mit der SperrungPuffer für 30 min bei RT auf einem Schüttler-Plattform. Spülen Sie die Membran in 1x TBS für 5 min. Inkubieren Sie die Membran mit anti-DIG-Antikörper, Verdünnung 1μl des Anti-Digoxigenin-AP in 10 ml 1x TBS, für 45 min bei RT. Waschen Sie die Membran zweimal in 1x TBS für je 15 min. Äquilibrieren Sie die Membran in 1x TN-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 9,5, 100 mM NaCl) für 5 min. Stain der Membran durch Inkubation mit NBT / BCIP 1 / 50 (v / v) in 1x TN-Puffer. Die Färbung kann 5-10 min. Danach spülen Sie die Membran mit Wasser, es kann dann getrocknet und aufbewahrt werden, als ein Rekord. Hinweis: NBT / BCIP ist ein Substrat für die alkalische Phosphatase konjugiert, die anti-DIG-Antikörper, der bei der Hydrolyse entsteht ein dunkelblauer Farbstoff. 3. Sectioning Warm die Blöcke auf Raumtemperatur. Wenn die Blöcke zu kalt sind, kann einzelne Abschnitte überschlagen ohne Bildung eines Wachs 'Band'. Trim Block in ein Trapezzoid Form verlassen ca. 1mm aus Wachs um die Probe. Warm up eine große Rutschbahn wärmer bei 35-37 ° C. Hinweis: Viele Protokolle dieser Schritt bei 42 ° C aber die Verringerung der Temperatur auf 35-37 ° C verhindert die Bildung von Blasen unter den Sektionen. Platzieren Sie den Block auf dem Mikrotom, so dass die längere der beiden parallelen Flächen an der Unterseite ist. Vorsichtig bringen den Block nach vorne auf die Klinge und stellen Sie sicher, dass die Oberfläche des Blocks parallel zur Klinge. Section bei einer Dicke von 8 – 10 um. Das Wachs Bänder können auf eine nicht-klebrige Oberfläche, wie Aluminiumfolie oder Filterpapier, ausgerichtet werden, um Abschnitte von Interesse auszuwählen. Dies kann anhand einer in der Nähe Präpariermikroskop werden. Hinweis: Die Eosin Färbung des Gewebes liefert einen Hinweis, ob das Gewebe ist richtig bei der Einbettung infiltriert. Wenn die Mitte des Blocks ist nicht mit Eosin zeigt dies für gewöhnlich, dass das Gewebe schlecht fixiert ist. Mark Probe-on Plus-slides mit einem Bleistift (die meisten Stifte oder Marker sind in der in-situ-Hybridisierung Protokoll gelöscht) und verteilen 1ml von sauberen milliQ H 2 O auf sie. Sorgfältig float Abschnitte von Interesse auf der Oberfläche des Wassers bei Raumtemperatur (es ist einfacher, die Abschnitte auf dem Wasser zu manipulieren, wenn Arbeiten bei Raumtemperatur). Stellen Sie sicher, dass die glänzende Seite (der Unterseite als das Farbband kommt der Mikrotom) das Wasser steht. Übertragen Sie anschließend die Folie langsam auf den Objektträger wärmer. Heizung hilft die Abschnitte auf der Oberfläche des Wassers zu verbreiten. Nach 5 min, abgießen vorsichtig, aber in einer fließenden Bewegung, so die Band ist nach unten auf die Folie abgesenkt. Lassen Sie die Folien trocken für mindestens einige Stunden oder über Nacht bei 37 ° C, so das Gewebe haftet. Hinweis: Aufgeschnittenes Gewebe in einer Box mit Silica-Trockenmittel kann für ein paar Tage bis Wochen bei 4 ° C gelagert werden, jedoch ist es am besten, um die Folien so schnell wie möglich zu verwenden. 4. In situ Hybridsierung § Vorbehandlung Das Volumen für jede Lösung benötigt wird natürlich auf die Anzahl der Folien zu behandeln und zu der Behältergröße abhängig. Die Abschnitte sollten immer vollständig untergetaucht werden. Für einen 25-Dia-Rack und eine ordentlich passende Behälter ist 200-250 ml ausreichend. Da viele der Inkubationsschritte sehr kurz sind, wir in der Regel bereiten alle möglichen Lösungen und erst dann beginnen die Folie Vorbehandlungen. Allerdings wird die Essigsäureanhydridlösung müssen sofort vorbereitet werden vor der Verwendung und Protease zum Zeitpunkt der Verwendung hinzugefügt wird. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, es sei denn anders vermerkt. Außerdem können alle Puffer bei 10-facher Konzentration als Stammlösung hergestellt werden. Warm die Protease-Puffer (100 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA) in den Behälter auf 37 ° C. Entparaffinieren und Rehydrierung der Gewebeschnitte wie folgt: histoclear – 10 min (Verwendung einer Glasschale) histoclear – 10 min (mit einemGlasschale) 100% Ethanol – 1 min 100% Ethanol – 30 sec 95% Ethanol – 30 sec 85% Ethanol – 30 sec 70% Ethanol – 30 sec 50% Ethanol – 30 sec 30% Ethanol – 30 sec 10% Ethanol – 30 sec milliQ H 2 O – 1 min Inkubieren in 1x PBS für 2 min. Mix 625μl Protease 50mg/ml in 250 ml Protease-Puffer vorgewärmt auf 37 ° C und die Objektträger für 20 min bei 37 ° C. Hinweis: Die Protease ist erforderlich, um feste Proteine ​​zu verdauen und zu erhöhen Sonde Zugang zu zellulären RNAs. Es wichtig, die Zeit der Inkubation Kontrolle der Hybridisierung Signal ohne Zusammenbruch des Gewebes zu maximieren, so dass einige Optimierungen können für jede Gewebeprobe erforderlich. Neutralisieren Sie die Protease-Aktivität in 0,2% Glycin in 1x PBS für 2 min. Spülen Sie die Folien sofort in 1x PBS für 2 min. Behandeln Sie die Dias in 4% PFA-Lösung für 10 min wieder fix die RNA, die durch die Protease-Behandlung beschädigt werden könnten. Spülen Sie die Folien zweimal in 1x PBS für 2 min je. Während die Folien in der PBS sind Waschen, Make-up 250 ml von 0,1 M Triethanolamin-Lösung pH 8,0 durch Mischen mit 12,5 ml 2M Triethanolamin (29.8g in 100ml milliQ H 2 O, pH 8,0 mit HCl) in 236,25 ml milliQ H 2 O in einer Glasschale. Add 1,25 ml Acetanhydrid in die Triethanolaminpuffer sofort, bevor Sie die Folien in, und gut umrühren. Nach dem Hinzufügen der Dias, weiterhin langsam rühren für 10 Minuten. Dies erfordert, dass die Folie Rack in den Container von Triethanolamin / Essigsäureanhydrid erhöht ist. Wir verwenden ein Spannsystem mit Stativ. Hinweis: In diesem Schritt werden positiv geladene Aminogruppen, die unspezifische Bindung der Sonde führen können acetyliert. Außerdem ist Essigsäureanhydrid giftig; dieser Lösung sollte daher in einem Abzug vorbereitet werden und ordnungsgemäß entsorgt werden <./ Li> Spülen Sie die Folien zweimal in 1x PBS für 2 min. Entwässern der Gewebeschnitte wieder: H 2 O – 1 min 10% Ethanol – 30 sec 30% Ethanol – 30 sec 50% Ethanol – 30 sec 70% Ethanol – 30 sec 85% Ethanol – 30 sec 95% Ethanol – 30 sec 100% Ethanol – 30 sec 100% Ethanol – 30 sec Hinweis: Dias können in einem Behälter mit einer kleinen Menge von 100% Ethanol an der Unterseite bis zu mehreren Stunden bei 4 ° C gelagert Hybridisierung Warm einem Heizblock auf 85 ° C. Bereiten Sie die Hybridisierungspuffer. Für 10 ml, mischen in einem Falcon-Röhrchen 1,25 ml in situ Hybridisierung Salze (3M NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM Na-Phosphat pH 6,8, 50 mM EDTA), 5 ml deionisiertes Formamid, 2,5 ml 50% Dextransulfat, 250 ul 50x Denhardt, 125 ul 100mg/ml tRNA, und 875 ul H 2 O. <br /> Hinweis: Dextransulfat ist sehr zähflüssig, so ist es am besten zur Vorwärmung der Lösung auf 60 ° C zu machen Pipettieren leichter. Hybridisierungspuffer können gespeichert werden bei -20 ° C. Bereiten Sie die verschiedenen Sonden. Für jede Folie, mischen Sie 1 ul-Sonde mit 9 ul milliQ H 2 O und 10 ul deionisiertem Formamid. Wärme der Sonde bei 85 ° C für 2-3 min, sofort kalt auf dem Eis, kurz zentrifugieren und fügen Sie die Sonde auf 80μl Hybridisierungspuffer pro Folie. Gut mischen durch Pipettieren, aber vermeiden Sie Blasen. Hinweis: Die Höhe der Sonde pro Objektträger hinzugefügt werden muss empirisch überprüft werden. Im Allgemeinen sind Sonden mit einer Endkonzentration von 0,5 ng / kb / ul Sonde Komplexität verwendet. Da Hybridisierungen mit 100 ul pro Folie durchgeführt werden, ist ca. 25 ng der Sonde pro Objektträger für Sonden, die 0,5-kb in der Länge und 50 ng Sonde pro Objektträger für Sonden, die 1-kb lang sind erforderlich. Der Einfachheit halber haben wir oft versuchen, 0,5, 1 und 4 ul-Sonde pro Objektträger. Legen Sie die Dias auf einersaubere Oberfläche und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen für 5-10 min. Pipettieren der Sonde / Hybridisierungspuffer Masse auf den rechten Rand der Folie. Allmählich niedrigeren einem Deckglas auf den Objektträger, um sicherzustellen, dass die Hybridisierungslösung alle Bereiche abdeckt, ohne Blasen. Tippen Sie auf das Deckglas leicht mit dem Finger, wo sich Blasen bilden, um sie von allen Gewebeschnitten zu verdrängen. Ziehen Sie nicht das Deckglas ab, da dies die Abschnitte beschädigt wird. Hinweis: Eine alternative Methode gewöhnlich für diesen Schritt verwendet wird, um "Sandwiches" aus zwei Folien, die mit der gleichen Sonde inkubiert vorzubereiten. Für weitere Einzelheiten über diese Methode, vgl. Rz. 14. Bereiten Sie eine feuchte Kammer in einer vollkommen ebenen Kunststoff-Box. Bedecken Sie den Boden der Box mit Whatman-Papier angefeuchtet mit milliQ Wasser, bedeckt das Papier mit Parafilm verlassen den Ecken entdeckt, legen Sie die Folien in der Plastikbox und verschließen die Kiste dicht. Inkubieren Sie die Folien in der gewünschten Hybridisierungstemperatur, in der Regel 50 bis 55 ° C, foder 16-20 Stunden. Für den Einsatz am nächsten Morgen vorzubereiten 1 Liter 0.2x SSC und speichern Sie diese bei 55 ° C. Darüber hinaus bereiten 1 Liter NTE-Puffer (0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0) und speichern bei 37 ° C. Post-Hybridisierung Behandlung Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig, um nicht beschädigt Abschnitte. Legen Sie die Folien in einem Rack und waschen Sie sie zweimal in 0,2 x SSC bei 55 ° C für eine Stunde. Hinweis: Die Deckgläser oft fallen leichter, wenn die Folien aufrecht gestellt werden. Wenn das Deckglas haften bleibt, tauchen Sie die Folie in warmen 0.2x SSC für 1 oder 2 min auf dem Deckglas abwaschen. Vermeiden Sie es, das Deckglas des Schlittens, da dies eine Beschädigung der Teile führen können. In der Zwischenzeit bereiten 500 ml Waschpuffer (1% BSA, 0,3% Triton in TBS-Puffer) und 100 ml Blocking-Lösung (0,5% Blockierungsreagenz in TBS-Puffer). Rühren Sie die Blockierung Pulver in TBS, die langsam auf 70 ° C erhitzt und abkühlen lassen auf Raumtemperatur einmal dissolvhg. Hinweis: Die Volumina Waschpuffer und Blocking-Lösung benötigt werden, hängt von der Größe der Wohnung Kunststoff-Box in Schritten 4.3.8 -11 verwendet. Es wird einige Zeit dauern, um sich vollständig aufzulösen Triton, so bereiten genug Lösung im Voraus. Äquilibrieren Sie die Folien in 1x NTE für 2 min. Fahren Sie mit dem RNAse A Behandlung durch die Übertragung der Objektträger in 1x NTE Puffer, um die 20μg/ml RNAse A hinzugefügt wird kurz vor Gebrauch bei 37 ° C für 30 min. Hinweis: RNAse A spaltet kostenlose Single-stranded RNA als auch auf Diskrepanzen in RNA-Doppelstränge. Dieser Schritt hilft bei der Reduzierung der Ebene der nicht-spezifische Bindung der Sonde, wie gespalten untersucht Fragmente in der letzten 0.2x SSC waschen (siehe 4.3.6) gewaschen werden. Spülen Sie die Folien zweimal in 1x NTE für je 2 min. Waschen Sie die Slides in frischen 0.2x SSC bei 55 ° C für eine Stunde. Äquilibrieren Sie die Folien in 1x PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Die Objektträger aus dem Rack auf the Boden einer flachen Kunststoff-Box und bedecken sie mit einem minimalen Volumen von Blocking-Lösung. Blockieren Sie die Objektträger für 45 min auf einem schüttelte langsam Plattform. Die Objektträger in einem zweiten sauberen flachen Kunststoff-Box und waschen Sie sie für 45 min mit Waschpuffer auf einem Schütteltisch. Fahren Sie mit dem Antikörper-Inkubation. Verdünnen Sie die Anti-Digoxigenin-Antikörper in Waschpuffer (1:5 v / v) und entweder einen minimalen Volumen direkt auf die einzelnen Folien oder legen Sie das Bild in eine flache Kunststoff-Box und bedecken sie mit einem minimalen Volumen von Antikörper-Lösung. Inkubieren Sie die Objektträger im Dunkeln für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. Waschen Sie die Slides 4-mal für je 15 min mit Waschpuffer beim Schütteln Plattform. Verwenden Sie ein minimales Volumen Waschpuffer und eine flache Kunststoff-Box. Reinigen Sie die Kunststoff-Box zwischen den einzelnen Wäschen. Hinweis: Reinigung der Box zwischen den Wäschen reduziert den allgemeinen Hintergrund auf der Folie. Um dies zu vereinfachen, verwenden wir zwei identische flache Kistenund übertragen Sie die Folien in einer sauberen Box nach jeder Wäsche. Die Objektträger in 1x TBS für 2 min. Äquilibrieren Sie die Folien in TN-Puffer zweimal für je 2 min. Bereiten Färbelösung unmittelbar vor Gebrauch durch Zugabe von 20 ul NBT / BCIP pro 1 ml TN-Puffer. Gießen Sie die Färbelösung in einer kleinen Kunststoff-Waagschale. Sandwich zwei Folien zusammen mit den Abschnitten einander zugewandt sind. Dip einer Längsseite des Sandwich in der Lösung, so dass die Kapillarwirkung nach oben zu ziehen die Lösung. Lassen Sie die Folien auf einem Kimwipe und füllen Sie die Folien mit Antikörper-Lösung wieder. Möglicherweise müssen Sie die Folien Leitungswasser als die Lösung fließt, um Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Folien in einer Plastikbox und bei Raumtemperatur lagern im Dunkeln. Tag 10 bis Tag 15: Aktualisieren Sie die Färbelösung zweimal täglich für 1-5 Tage durch Spülen der Objektträger in TN-Puffer und die Ausarbeitung neuer Sandwiches mit frischem Färbelösung. Hinweis: Ersetzen der Färbelösung in regelmäßigen intervals wird das Signal-Hintergrund-Verhältnis zu verbessern. Entwicklung des Signals kann unter einer Verbindung oder Stereo-Mikroskop beobachtet werden. Es ist möglich, die Abschnitte fotografieren, während sie in TN-Puffer zwischen den Runden der Färbung sind oder sobald sie in Wasser kurz vor der permanenten Montage übertragen. Montage Sobald das Signal ist klar, spülen Sie die Folien in milliQ H 2 O und entwässern sie schnell durch eine Ethanol-Serie: 10% Ethanol – 10 s 30% Ethanol – 10 s 50% Ethanol – 10 s 70% Ethanol – 5 s 80% Ethanol – 5 s 95% Ethanol – 5 s 100% Ethanol – 5 s histoclear – 2 min histoclear – 2 min Hinweis: Achten Sie auf jede dieser Inkubationszeiten kurz zu halten, da das Signal Ethanol löslich ist. Montieren Sie die Folien, indem Sie einen oder zwei Tropfen Toluol-based Eindeckmedium auf jeder geschobene und langsam senken das Deckglas auf den Objektträger Vermeidung der Bildung von Blasen. Lassen Sie die Eindeckmittel härtet über Nacht vor der Analyse das Ergebnis unter einem zusammengesetzten Mikroskop. Einmal montiert, können Folien seit Jahren bei Raumtemperatur gelagert werden. 5. Repräsentative Ergebnisse: Nach 1-5 Tagen wird ein rot-lila-Signal in den Zellen, wo die Sonde an komplementäre Transkripte (Abbildung 1) hybridisiert hat entwickeln. Das Farbsignal stellt somit eine direkte Visualisierung auf zellulärer Auflösung des Expressionsmuster des Gens von Interesse. Ein schwächerer Hintergrundfärbung kann auch zu entwickeln, die sich aus der nicht-spezifische Bindung der Sonde oder Färbung des pflanzlichen Geweben (Abbildung 3). Solche Hintergrund-Signal ist möglicherweise relativ stärker in die kleinen, weniger bestimmt Zellen des Gewebes, aber Hintergrundfärbung würde auch in den Abschnitten hybridisiert, um die negativen und positiven Kontrolle Sonden beobachtet werden und würde nichtreproduzierbar zwischen den Experimenten. Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse mit unterschiedlichen Sonden auf Arabidopsis und Mais Gewebe erhalten. In situ Hybridisierungen von Arabidopsis (AD) und Mais (EH) Gewebe mit verschiedenen Gen-spezifischen Sonden, welche die Art der Ergebnisse, die nach dem erfolgreichen Abschluss der skizzierten Protokoll erwartet werden kann. (A) Lokalisation von SHOOTMERISTEMLESS1 (STM) in der Arabidopsis vegetative Sprosszellen; beachten Sie die Anwesenheit von lila blau-Signal in der unbestimmten Zellen der Meristem und das Fehlen des Signals in die umliegenden Blätter. (BD) Abschnitte von Arabidopsis Torpedo Embryonen zeigen CLAVATA3 (B) Expression in den wenigen embryonalen Stammzellen untersucht AtML1 (C) Expression in der Epidermis, und das Fehlen des Signals in Abschnitte mit einer zufälligen negativen Kontroll-RNA (D). (E) Lokalisation des STM homolog knotted1 in den Entwicklungsländern Mais Embryo; beachten Sie, das starke Signal speziell in der embryonalen Meristem und Wurzel. (FH) Längsschnitte durch das vegetative Sprosszellen aus Mais zeigt deutliche in-situ-Hybridisierung Muster für arf3a (F) und ocl4 (G) und keine Hybridisierung Signal für die negative Kontrolle Sonde (H). arf3a befindet sich auf der abaxialen / unten Blattoberfläche ausgedrückt, während die AtML1 homolog ocl4 ist speziell in der Epidermis exprimiert. Die folgenden Gen-Fragmente wurden als Sonde verwendet: STM: Die cDNA Region, die Aminosäuren 81 bis 382, die den konservierten homeodomain umfasst; CLV3: die volle Länge cDNA; AtML1: das dritte Exon; kn1: Die gesamten offenen Leserahmen; arf3a: Nukleotide 9 bis 225 von cDNA-Klon HM004539; ocl4: 3 '1,7 kb der vollen Länge cDNA, die mehrere konservierte Proteindomänen gehören. <p class = "jove_content"> Abbildung 2. Überprüfen Punkte während Sie in vitro-Transkription Sonden. (A) In-situ-Hybridisierung Sonden sind auf einem Standard-Agarosegel nach in vitro-Transkription überprüft (a), nach DNase-Behandlung und anschließende Reinigung des in vitro Transkriptions-Reaktion (b), nachdem Carbonat Hydrolyse-falls erforderlich-(c) und wenn einsatzbereit (d). Für Sonden über 250 bp in der Länge, wie Sonde 1 wird das Carbonat Hydrolyse liefern eine Reihe von kleineren Sonde Fragmente (Bügel). (B) Kolorimetrische Quantifizierung der Sonden durch Dot-Blot-Analyse. Verdünnungen von 10 -1 bis 10 -5 von 100 ng / ul-Sonde (1) und der drei neu DIG-markierten Sonden (2-4) sind auf einen Transfer Membran, mit Anti-DIG-Antikörper entdeckt und untersucht mit dem kolorimetrischen Assay in Abschnitt 2.3 des Protokolls beschrieben. Die Analyse legt nahe,die folgenden geschätzten Konzentrationen: Probe 2, ~ 100 ng / ul; Sonde 3, ~ 10 ng / ul Sonde 4, ~ 1 ng / ul. Probe 4 ist unwahrscheinlich, dass eine gute in-situ-Hybridisierung Signal liefern. Abbildung 3. Vergleich einer nicht-spezifischen Sonde auf eine gut funktionierende Sonde. Längsschnitte durch das vegetative Sprosszellen aus Mais zeigt ein unspezifisches Hintergrundsignal (A) und einem spezifischen in-situ-Hybridisierung Signal für die OCL5 Sonde in die äußere Zellschicht (B). Abbildung 4. Schematische Darstellung der Zeitleiste der Schritte in der in-situ-Hybridisierung Protokoll. Tissue Einbettung Schritte sind in grün, probe-Vorbereitungsschritte in orange angezeigt, und die in-situ-Hybridisierung Schritte in blau. Diese Timeline Ansicht, dass die DNA template für die in vitro-Transkription der Sonde zur Verfügung steht. Parafin-eingebetteten Gewebe-Blöcke und DIG-markierten Sonden kann vorbereitet werden, und bei 4 ° C und -80 ° C bzw. bis zum Zeitpunkt der Verwendung. Die in-situ-Hybridisierung Protokoll kann dann in nur vier Tagen abgeschlossen sein.