Test d'activation des basophiles pour l'enquête des IgE dans les mécanismes d'hypersensibilité médicamenteuse

1. Préparation des conjugués de drogue Dissolvez 10 mg dans 1 ml de dH O 2 DF dans un tube de 1,5 ml de réaction. Dans la procédure utilisation ultérieure 95 ul de cette solution DF. Pour conjuguer PP à la HSA dissoudre 30,4 mg PP dérivés (304 g / mol) dans 500 pi 0,3 M d'hydroxyde de sodium (NaOH). Ajouter 430,6 ul dH 2 O et 100 ul 0,5 m 2 – (N-morpholino) éthanesulfonique (MES) tampon pH 6,5 à 95 ul de DF dissous. Ajouter 33,1 ul dH 2 O et 140 ul de 2 M MES tampon pH 2,9 à l'échantillon PP. Ajouter 57,5 ul d'une solution fraîchement préparée de N-éthyl-N '- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide solution mère (EDC) dissous dans dH 2 O avec une concentration de 100 mg / ml à l'échantillon DF, ou une solution de 10 ul d'EDC l'échantillon PP. Vortex les échantillons pendant 1 minute. Ajouter 16,9 pi de solution de HSA avec une concentration de 118 mg / ml à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant 2 heures à température ambiante tout en agitant à 300 tours / min. Dialyser le DF et les échantillons de PP 3 fois contre 2 litres de tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,4 pendant plusieurs heures chacune. Effectuez toutes les étapes de dialyse à 4 ° C. Centrifuger l'échantillon de 10 minutes à 14000 xg et recueillir les DF surnageant contenant ou PP conjugué à la HSA. Vérifiez surnageant pour les protéines en effectuant une SDS-PAGE, utilisant des gels à 12%. Charge d'environ 12 mg de HSA conjugué dans un slot de gel. 2. Déterminer le taux de couplage de la drogue conjugués (figure 2) Pour l'analyse du taux de couplage de DF et PP conjugués par HPSEC utiliser un 100 mM tampon phosphate de sodium pH 6,5 contenant 150 mM de NaCl et de l'azide de sodium à 0,05%. Utilisez un x 7,8 à 300 mm TSK-Gel-G2000 colonne SWXL. Effectuer la détection des signaux en utilisant une ligne couplée RI et le système de détecteur UV. Préparer un échantillon standard HSA avec une concentration de 1 mg / ml dans dH 2 O. Pour étalonnage du détecteur d'injecter 50 ul HSA solution standard. Calculer la RI RI k constante et l'UV UV k constant pour le détecteur. Utilisez la zone de formules RI = RI k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] et la zone UV UV = k * [(DA / DC) HSA * c (HSA)] avec (dn / dc) = HSA 0,185 et (DA / DC) = 0.518 HSA 5. Préparer DF et PP standards dérivés à des HPSEC que les montants de 5, 10 et 30 nmol de ces deux normes peuvent être facilement injectées. Calculer les valeurs moyennes de (dn / dc) et de la drogue (DA / DC) des médicaments pour les deux normes. Pour DF, un (dn / dc) de 0,235 ± 0,010 et un (DA / DC) de 39,000 ± 0,493 a été déterminé. Pour PP, un (dn / dc) de 0,328 ± 0,016 et un de (DA / DC) ± 2,464 53,155 a été déterminée. Injecter conjugués drogue sur HPSEC et de déterminer leur RI et UV domaines de pointe. Calculer la concentration de DF, dérivé PP, et HSA en résolvant les équations deux zones RI = RI k * [(dn / dc) des médicaments * c (médicament) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] UV région et UV = k * [(DA / DC) de drogue * c (médicament) + (DA / DC) HSA * c (HSA)] pour les inconnues. 3. BAT à l'aide de médicaments conjugués Préparer sept coupes cytométrie de flux et de les étiqueter selon leur contenu: le contrôle sans tache, le contrôle négatif, contrôle positif, et conjugués de drogue. Pipeter 50 pi de tampon de stimulation B-CCR-STB (Flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) dans les flacons réservés pour le contrôle sans tache et négatifs. Comme contrôle positif, utiliser 50 ul d'une solution anti-FceRI fournies par le kit Flow2 CAST. Ajouter la quantité appropriée de solution de conjugué à l'flacons réservés pour les conjugués de drogue en créant une série de dilution 1:10 de 0,02 -20 pg / ml DF et PP conjugué conjugué (concentrations finales dans un volume d'essai de 200 pi). Ces expériences de titration doit être réalisée pour déterminer la concentration d'activation des basophiles optimale pour chaque échantillon de patient. Ajouter 100 ul de tampon de stimulation à chaque tube de sang EDTA et 50 patients ul du tout. Mélanger les échantillons soigneusement. Pipeter 20 ul Flow2 réactif de révélation CAST contenant des anti-CCR3 anticorps marqués à la phycoérythrine (PE) et des anticorps anti-CD63 marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à chaque tube et mélanger à nouveau. Ne pas pipeter réactif de révélation dans l'échantillon non coloré! Incuber les échantillons pendant 45 minutes dans un bain d'eau à 37 ° C. Arrêtez la réaction sur la glace pendant 5 minutes. Lyse érythrocytes en ajoutant 2,0 ml de réactif CAST Flow2 lyse à chaque flacon et le vortex doucement. Incuber les échantillons dans l'obscurité pendant 10 minutes à température ambiante. Centrifuger les échantillons pendant 5 minutes à 500 xg et le surnageant décanter avec précaution. Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de lavage Flow2 CAST et de stocker la glace jusqu'à la cytométrie de flux. Ajustez la tension s le cytomètre en flux dearam è tres de diffusion vers l'avant et de côté (FSC, SSC) tout en acquérant de l'échantillon non colorées. Porte des cellules prédit que les lymphocytes de la parcelle SSC-FSC à l'intrigue SSC-PE. Les basophiles sont identifiés par un PE-anticorps anti-CCR3 anticorps comme CCR3 Salut lo SSC et les porte dans l'intrigue FITC-PE. L'anticorps anti-CD63 détecter les basophiles activés est marqué au FITC. Régler le seuil à maximum 2,5% de basophiles CD63 comme Salut dans le contrôle négatif. Un échantillon est considéré positif pour l'activation des basophiles, si basophiles> 5% sont CD63 salut et l'indice de fluorescence moyenne (IFM) de l'échantillon divisé par le MFI du contrôle négatif dépasse 2 (figure 3). 4. Les résultats représentatifs: Cette expérience évalue BAT comme un outil bénéfique pour détecter hypersensibilité médicamenteuse IgE-dépendante. Conjugués de protéines d'AINS sont utilisés pour l'activation des basophiles. Par HPSEC avec RI et de l'état d'agrégation détection UV, le degré de couplage et de rendement effectif des conjugués sont déterminées. Comme la figure 4 montre, 43,5% des conjugués DF resté monomères avec un degré de couplage de 5,0 DF / HSA. Pour les agrégats un degré de couplage de 9,5 a été déterminée. Le conjugué propyphenazone a été démontré que des monomères constitués de 68,5% avec un degré de couplage de 21,2. Le degré de couplage des agrégats était de 27,9. Au total, le degré de couplage déterminée de conjugués DF DF était de 7,6 et que des conjugués PP était de 23,2. BAT réalisé avec des conjugués dans des conditions optimisées (concentration des conjugués, le temps de stimulation) permis d'étudier les réactions IgE-dépendante dans l'hypersensibilité aux AINS. Comme le montre la figure 5, seul le PP a été conjugué à même de déclencher l'activation des basophiles visualisés par une régulation positive de l'expression en surface CD63: 20,6% des basophiles ont été activés caractérisée par un journal de changement dans l'intensité de fluorescence. L'IMF a augmenté par un facteur de 4,9 par 386 (témoin négatif) à 1893. En revanche, en utilisant le conjugué DF seulement 3,1% des basophiles ont été activés, qui était inférieur à 5% de coupure. Aussi l'IMF n'a augmenté que d'un facteur 1,1 (limite 2,0) à partir de 197 (témoin négatif) à 210. La validité de dosage est donnée par (i) <5% d'activation des basophiles dans le contrôle négatif, (ii) un journal de changement dans l'intensité de fluorescence d'une sous-population des basophiles, et (iii)> 50% basophiles activés (contrôle positif). Figure 1. Couplage des dérivés DF et PP à la HSA. Après dissolution de la drogue, l'eau, tampon MES, et EDC (réactif de couplage) sont ajoutés. Les échantillons sont vortexés pendant 1 minute avant de HSA est pipeté aux solutions de drogue. Dans les 2 heures d'agitation à température ambiante, la drogue de façon covalente se lient à la SAH. Monomères ainsi que des agrégats peuvent en résulter. Figure 2. Calcul des degrés d'accouplement. Tout d'abord, les constantes k RI et UV k sont déterminés. Par conséquent, HSA standard avec une concentration connue est injecté dans le système HPSEC. (Dn / dc) et (DA / DC) de HSA sont donné des valeurs de 0,185 et 0,518, respectivement 5. Les domaines de pointe sont utilisées pour calculer les constantes. Deuxièmement, pour chaque médicament trois normes sont injectés afin de déterminer la drogue et de la concentration et les zones spécifiques du RI UV. Depuis l'IR k et k constantes UV sont connus à partir des étapes précédentes, les dérivés de médicaments spécifiques (dn / dc) et (DA / DC) peut être calculé. Troisièmement, la drogue-SAH conjugués sont injectés dans HPSEC. Les aires des pics obtenus sont utilisés pour calculer les concentrations de médicament et HSA par de pointe en résolvant les deux équations à deux inconnues. Figure 3. Gating basophiles. Cellules prédit que les lymphocytes sont diffusion latérale fermée par rapport prodiffusion (SSC-FSC parcelle). Les basophiles sont identifiés comme CCR3 Salut lo CSE à partir des lymphocytes gated (SSC-CCR3-PE parcelle). Les basophiles sont analysés pour l'activation (CD63 Salut) dans la parcelle CD63-FITC-CCR3-PE. Le contrôle négatif est utilisé pour définir le seuil maximal des basophiles 2,5% restants CD63 Salut. Figure 4. Degrés de couplage Déterminé des conjugués drogue. Du RI et les signaux UV montrent deux pics représentant les agrégats (élution à volume faible rétention) et les monomères (élution à un volume élevé de rétention) des médicaments-SAH conjugués. Les pourcentages de monomères et d'agrégats (déterminé à partir des signaux IR) et de leurs degrés de couplage sont représentés (n = 1). Figure 5. Basophiles Activatile test. Résultats de la drogue conjugué activé échantillons, les contrôles négatifs, et les contrôles positifs sont indiqués dans le CD63-FITC-CCR3-PE parcelles (n = 1).