Basofiel activatie test voor Onderzoek van IgE-gemedieerde mechanismen in Drug Overgevoeligheid

1. Voorbereiding van de drug conjugaten Los 10 mg DF in 1 ml dH 2 O in een 1,5 ml reactie buis. Bij de verdere procedure gebruik 95 ul van deze DF oplossing. Om conjugaat PP aan HSA te ontbinden 30,4 mg PP afgeleide (304 g / mol) in 500 pi 0,3 M natriumhydroxide (NaOH). Voeg 430,6 ul dH 2 O en 100 ul 0,5 M 2 – (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES) buffer pH 6,5 tot 95 ul van de opgeloste DF. Voeg 33,1 ul dH 2 O en 140 ul van 2 M MES buffer pH 2,9 tot de PP monster. Voeg 57,5 ul van een vers bereide N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) voorraadoplossing opgelost in dH 2 O met een concentratie van 100 mg / ml voor de DF monster, of 10 ul EDC oplossing voor de PP monster. Vortex de monsters gedurende 1 minuut. Voeg 16,9 ul van HSA oplossing met een concentratie van 118 mg / ml aan elk monster. Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 300 ronden / min. Dialyze de DF-en PP-monsters drie keer tegen de 2 liter van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende enkele uren per stuk. Voer alle stappen dialyseren bij 4 ° C. Centrifugeer het monster 10 minuten bij 14.000 xg en verzamel de bovenstaande vloeistof met DF of PP geconjugeerd aan HSA. Controleer supernatant voor eiwitten door het uitvoeren van een SDS-PAGE, met behulp van 12% gels. Belasting ongeveer 12 ug van HSA conjugaat in een gel-sleuf. 2. Bepaal koppeling snelheid van drugs conjugaten (figuur 2) Voor de analyse van de koppeling snelheid van DF en PP-conjugaten door HPSEC gebruik maken van een 100 mM natriumfosfaat buffer, pH 6,5 met 150 mM NaCl en 0,05% natriumazide. Gebruik een 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 SWXL kolom. Voer detectie van signalen met behulp van een online-gekoppelde RI-en UV-detector systeem. Bereid een HSA standaard monster met een concentratie van 1 mg / ml in dH 2 O. Voor de detector kalibratie injecteren 50 ul HSA standaardoplossing. Bereken de constante k RI RI en de UV-k UV voor de detector. Gebruik de formules gebied RI = k RI * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = UV-k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] met (dn / dc) HSA = 0.185 en (dA / dc) HSA = 0,518 5. Bereid DF en PP afgeleide normen voor HPSEC die 5, 10 en 30 nmol hoeveelheden van beide normen kunnen gemakkelijk worden geïnjecteerd. Bereken gemiddelde waarden voor (dn / dc) drugs-en (dA / dc) drug voor beide standaarden. Voor DF, een (dn / dc) van 0,235 ± 0,010 en een (dA / dc) van 39,000 ± 0,493 werd bepaald. Voor PP, een (dn / dc) van 0,328 ± 0,016 en een (dA / dc) van 53,155 ± 2,464 werd bepaald. Injecteren geneesmiddel conjugaten op HPSEC en bepalen hun RI en UV piekoppervlakken. Bereken de concentratie van DF, PP derivaat, en HSA door het oplossen van de twee vergelijkingen gebied RI = k RI * [(dn / dc) drug * c (drug) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] en het gebied UV = k UV * [(dA / dc) drug * c (drug) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] voor de onbekenden. 3. BBT met behulp van drugs conjugaten Bereid zeven flowcytometrie flacons en label ze afhankelijk van hun inhoud: onbesmet controle, negatieve controle, positieve controle, en drugs conjugaten. Pipetteer 50 ul van de B-CCR-STB stimulatie buffer (flow2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) in de flesjes gereserveerd voor de ongekleurd en negatieve controle. Als een positieve controle, het gebruik 50 ui van een anti-FcεRI oplossing van de flow2 CAST kit. Voeg de juiste hoeveelheid conjugaat oplossing om de flesjes gereserveerd voor de drug conjugaten door het creëren van een 1:10 verdunning serie van 0,02 -20 ug / ml DF conjugaat en PP-conjugaat (eindconcentraties in een assay volume van 200 pi). Deze titratie-experimenten moeten worden uitgevoerd om de concentratie van optimale basofielen activatie voor elke patiënt monster te bepalen. Voeg 100 ul buffer stimulatie aan elke buis en 50 ul patiënt EDTA volbloed. Meng de monsters. Pipetteer 20 ul flow2 CAST vlekken reagens met anti-CCR3 antilichamen die zijn gemerkt met phycoerythrine (PE) en anti-CD63 antilichamen die zijn gemerkt met fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) aan elke buis en meng opnieuw. Niet pipet vlekken reagens in de ongekleurd monster! Incubeer de monsters gedurende 45 minuten in een 37 ° C waterbad. Stop reactie op ijs gedurende 5 minuten. Lyse erytrocyten door het toevoegen van 2,0 ml flow2 CAST lyserend reagens aan elke flacon en vortex voorzichtig. Incubeer monsters in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Centrifuge monsters voor 5 minuten bij 500 xg en decanteer zorgvuldig supernatant. Resuspendeer cellen in 500 pi flow2 CAST wasbuffer en op te slaan op het ijs tot flowcytometrie. Stel de flowcytometer het voltage snstellingen voor vooruit en zijwaartse verstrooiing (FSC, SSC), terwijl het verwerven van de ongekleurd monster. De poort van de cellen voorspeld als lymfocyten uit het SSC-FSC-complot om de SSC-PE-plot. Basofielen zijn te herkennen aan een PE-gelabeld anti-antilichaam CCR3 als CCR3 hi SSC lo en gate ze in de FITC-PE plot. De anti-CD63 antilichaam detectie geactiveerd basofielen is gelabeld met FITC. Stel de cut-off tot maximaal 2,5% van de basofielen als CD63 hi in de negatieve controle. Een monster wordt als positief voor basofielen activatie indien> 5% basofielen zijn CD63 hi en de gemiddelde fluorescentie-index (MFI) van het monster gedeeld door de MFI van de negatieve controle groter is dan 2 (Figuur 3). 4. Representatieve resultaten: Dit experiment evalueert BBT als een heilzaam middel om IgE-afhankelijke overgevoeligheid voor geneesmiddelen op te sporen. Eiwit conjugaten van NSAID's worden gebruikt voor de activering van basofielen. Door HPSEC met RI-en UV-detectie aggregatie toestand, koppeling graad, en de effectieve rendement van de conjugaten worden bepaald. Zoals figuur 4 laat zien, 43,5% van de DF conjugaten bleef monomeer met een koppeling mate van 5.0 DF / HSA. Voor de aggregaten een koppeling graad van 9,5 werd vastgesteld. De propyphenazone conjugaat bleek te bestaan ​​uit 68,5% monomeren met een koppeling graad van 21,2. De koppeling mate van de aggregaten was 27,9. In totaal heeft de vastgestelde koppeling mate van DF conjugaten was 7,6 DF en die van PP conjugaten was 23,2. BAT uitgevoerd met conjugaten onder optimale omstandigheden (concentratie van conjugaten, stimulatie tijd) mag het onderzoek van IgE-afhankelijke reacties in NSAID overgevoeligheid. Zoals weergegeven in figuur 5, alleen de PP conjugaat kon veroorzaken basofielen activatie gevisualiseerd door een opregulatie in CD63 oppervlakte expressie: 20,6% van de basofielen werden geactiveerd gekenmerkt door een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit. De MFI verhoogd met een factor van 4,9 van de 386 (negatieve controle) naar 1893. In tegenstelling, het gebruik van de DF conjugaat slechts 3,1% van de basofielen werden geactiveerd die lager was dan de 5% cut-off. Ook de MFI nam slechts met een factor 1,1 (limiet 2,0) van 197 (negatieve controle) tot 210. Test validiteit wordt gegeven door (i) <5% basofielen activatie in de negatieve controle, (ii) een log-verschuiving in de fluorescentie-intensiteit van een basofiele subpopulatie, en (iii)> 50% geactiveerde basofielen (positieve controle). Figuur 1. Koppeling van DF en PP-afgeleide aan HSA. Na de ontbinding van de drugs, water, MES buffer, en EDC (koppeling reagens) worden toegevoegd. De monsters zijn gevortexed gedurende 1 minuut voordat HSA is gepipetteerd om het geneesmiddel oplossingen. Binnen de 2 uur schudden bij kamertemperatuur de drugs covalent binden aan HSA. Monomeren en aggregaten kan veroorzaken. Figuur 2. Berekening van de koppeling graden. Eerst worden de constanten k RI en k UV bepaald. Daarom wordt HSA standaard met een bekende concentratie geïnjecteerd in het HPSEC systeem. (Dn / dc) en (dA / dc) van HSA worden gegeven waarden van 0,185 en 0,518, respectievelijk 5. De piek gebieden zijn gebruikt voor het berekenen van de constanten. Ten tweede, voor elk geneesmiddel drie normen zijn geïnjecteerd met drug-en concentratie-specifieke RI en UV-gebieden te bepalen. Omdat de k RI en k UV-constanten zijn bekend uit de bovenstaande stappen, kan de drug-specifieke (dn / dc) en (dA / dc) derivaten worden berekend. Ten derde, drug-HSA conjugaten worden geïnjecteerd in HPSEC. De resulterende piekoppervlakken worden gebruikt om de concentraties van het geneesmiddel en HSA per piek te berekenen door het oplossen van de twee vergelijkingen met twee onbekende variabelen. Figuur 3. Basofiele gating. Cellen voorspeld als lymfocyten zijn gated zijwaartse verstrooiing versus voorwaartse verstrooiing (SSC-FSC plot). De basofielen zijn geïdentificeerd als CCR3 hi SSC lo van de gated lymfocyten (SSC-CCR3-PE plot). Basofielen worden geanalyseerd voor de activering (CD63 hi) in de CD63-FITC-CCR3-PE plot. De negatieve controle wordt gebruikt om de cut-off van maximaal 2,5% basofielen resterende CD63 hi in te stellen. Figuur 4. Vastberaden koppeling graden van drugs conjugaten. RI-en UV-signalen tonen twee pieken van aggregaten (eluerend bij lage retentie volume) en monomeren (elueren met een hoog retentie volume) van het geneesmiddel-HSA conjugaten. Percentages van monomeren en aggregaten (bepaald op basis van RI-signalen) en hun koppeling graden zijn afgebeeld (n = 1). Figuur 5. Basofiele activatiop de test. Resultaten van het geneesmiddel conjugaat-geactiveerde monsters, negatieve controles, en positieve controles worden getoond in CD63-FITC-CCR3-PE percelen (n = 1).