Bilaminar co-coltura di neuroni corticali primari di ratto e Glia
Summary
Qui forniamo un protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto in presenza di uno strato alimentatore gliali. I neuroni coltivati stabilire la polarità e di creare le sinapsi, e può essere separato dalla glia per l'utilizzo in diverse applicazioni, quali elettrofisiologia, imaging del calcio, saggi di sopravvivenza cellulare, immunocitochimica, e RNA / DNA / isolamento delle proteine.
Abstract
Questo video vi guiderà attraverso il processo di neuroni corticali di ratto coltura in presenza di uno strato alimentatore gliali, un sistema noto come bilaminar o co-coltura modello. Questo sistema è adatto per una varietà di esigenze sperimentali che richiedono sia un substrato di vetro o di plastica e la crescita può essere utilizzato anche per la cultura di altri tipi di neuroni.
Neuroni corticali di ratto ottenuto dalla fase tardo embrionale (E17) sono placcati in coprioggetto di vetro o piatti coltura di tessuti di fronte a un alimentatore strato di cellule gliali cresciuti su piatti o lamelle di plastica (noto come Thermanox), rispettivamente. La scelta tra le due configurazioni dipende dalla specifica tecnica sperimentale utilizzata, che può richiedere, o meno, che i neuroni sono cresciuti su vetro (es. calcio di imaging contro Western Blot). Lo strato alimentatore gliali, un astroglia arricchito la cultura secondaria di cellule gliali misti, è separata preparata dalla corteccia di cuccioli di ratto appena nati (P2-4) prima della neuronaledissezione.
Uno dei principali vantaggi di questo sistema di coltura rispetto ad una cultura di neuroni è solo il sostegno della crescita neuronale, la sopravvivenza e la differenziazione forniti da fattori trofici secreto dallo strato alimentatore gliali, che assomiglia più accuratamente l'ambiente cervello in vivo. Inoltre, il co-cultura può essere utilizzato per studiare le interazioni neuroni-glia 1.
Allo stesso tempo, la contaminazione glia nello strato neuronale è impedita da diversi mezzi (cultura bassa densità, l'aggiunta di inibitori della mitosi, la mancanza di siero e di uso di mezzo di coltura ottimizzato) che porta a un livello praticamente puro neuronale, paragonabile ad altre modalità stabilite 1 -3. I neuroni possono essere facilmente separato dallo strato gliale in qualsiasi momento durante cultura e utilizzati per diverse applicazioni sperimentali che vanno dal 4 elettrofisiologia, biologia cellulare e molecolare 5-8, biochimica 5, imaging e microfonoroscopy 4,6,7,9,10. I neuroni primari estendere assoni e dendriti di formare sinapsi funzionali 11, un processo che non si osserva in linee cellulari neuronali, anche se alcune linee cellulari si estendono i processi.
Un protocollo dettagliato dei neuroni dell'ippocampo di ratto coltura utilizzando questo sistema di co-coltura è stato descritto in precedenza 4,12,13. Qui dettaglio un protocollo modificato adatto per i neuroni corticali. Come circa 20×10 6 celle vengono recuperati da ogni embrione di ratto, questo metodo è particolarmente utile per gli esperimenti che richiedono un gran numero di neuroni (ma non preoccupati per una popolazione altamente omogenea neuronale). La preparazione dei neuroni e glia deve essere pianificato in un tempo specifico modo. Vi forniremo il passo-passo protocollo per la coltura di neuroni corticali di ratto e coltura delle cellule gliali di supporto ai neuroni.
Protocol
Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per la coltura topo neuroni corticali primarie in presenza di cellule gliali, mentre i neuroni permettendo di essere facilmente isolate per l'analisi sperimentale. Lo sviluppo di supporto gliali di un fenotipo sano neuronale, mentre le risposte neuronali modulando anche a trattamenti sperimentali in un modo fisiologicamente rilevanti. Inoltre, per passaging la glia primaria prima coltura con neuroni questa popolazione cellulare diventa selettivo arricchito in astrociti, impedendo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano i membri di laboratorio precedenti che hanno contribuito al perfezionamento di questo protocollo e l'NIH per il supporto nel corso degli anni (DA19808 e DA15014 a OM). Anna Abt 1 è un collega della "formazione mediante la ricerca interdisciplinare e traslazionale in neuroAIDS" (T32-MH078795): così, questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institutes of Health Research sotto Ruth L. Kirschstein Premio Nazionale Servizio 5T32MH079785.
Materials
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Glucose | 16 mM |
| Sucrose | 22 mM |
| NaCl | 135 mM |
| KCl | 5 mM |
| Na2HPO4 | 1 mM |
| KH2PO4 | 0.22 mM |
| HEPES | 10 mM |
| pH | 7.4 |
| Osmolarity | 310±10 mOsm |
Table 1. Dissection Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| FBS | 10% |
| Gentamicin | 50 μg/mL |
Tabe 2. Glia Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 90% |
| Horse Serum | 10% |
Table 3. Neuron Plating Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| DMEM | 98% |
| N2 Supplement | 1% |
| 1M HEPES | 1% |
| Ovalbumin | 50 mg/100mL |
Table 4. N2 Medium.
| Reagent | Concentration |
|---|---|
| Boric Acid | 50 mM |
| Sodium Borate | 12.5 mM |
Table 5. Borate Buffer (for poly-lysine).
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) |
Invitrogen | 11995-073 |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat-inactivated | Hyclone | 26400-044 |
| Horse Serum, Heat-inactivated | Hyclone | H1138 |
| Gentamicin (50mg/mL) | Invitrogen | 15750-060 |
| N2 Supplement (100x) | Invitrogen | 17502-048 |
| HEPES buffer solution | Invitrogen | 15630-080 |
| Albumin from chicken egg white, Grade VI (Ovalbumin) |
Sigma-Aldrich | A2512 |
| 2.5% Trypsin | Invitrogen | 15090-046 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) |
Sigma-Aldrich | D-5025 |
| Paraplast | Fisher | 12-646-106 |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 |
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma-Aldrich | C6645 |
| Stereomicroscope | Leica | Leica ZOOM 2000 |
| Cover glasses, Circles, 15 mm, Thickness 0.13-0.17 mm |
Carolina | 633031 |
| Thermanox sheets | Grace BioLabs | HS4550 |
| Large forceps | Biomedical Investigación Instruments |
70-4000 |
| Fine-tipped No.5 forceps | Fine Science Tools |
91150-20 |
| Pattern No.1 forceps | Biomedical Investigación |
10-1400 |
| Instruments | ||
| Scissors, straight, sharp-blunt | Biomedical Investigación Instruments |
28-1435 |
| Micro Dissecting scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-2070 |
| Micro Dissecting Curved scissors | Biomedical Investigación Instruments |
11-1395 |
Referencias
- Cook, A. Interactions between chemokines: regulation of fractalkine/CX3CL1 homeostasis by SDF/CXCL12 in cortical neurons. J. Biol. Chem. 285, 10563-10563 (2010).
- Nicolai, J., Burbassi, S., Rubin, J., Meucci, O. CXCL12 inhibits expression of the NMDA receptor’s NR2B subunit through a histone deacetylase-dependent pathway contributing to neuronal survival. Cell. Death. Dis. 1, e33-e33 (2010).
- Sengupta, R. Morphine increases brain levels of ferritin heavy chain leading to inhibition of CXCR4-mediated survival signaling in neurons. J. Neurosci. 29, 2534-2544 (2009).
- Meucci, O. Chemokines regulate hippocampal neuronal signaling and gp120 neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 14500-14500 (1998).
- Khan, M. Z. Regulation of neuronal P53 activity by CXCR 4. Mol. Cell. Neurosci. 30, 58-66 (2005).
- Patel, J. P. Modulation of neuronal CXCR4 by the micro-opioid agonist DAMGO. J. Neurovirol. 12, 492-500 (2006).
- Shimizu, S. Role of the transcription factor E2F1 in CXCR4-mediated neurotoxicity and HIV neuropathology. Neurobiol. Dis. 25, 17-26 (2007).
- Khan, M. Z. The chemokine receptor CXCR4 regulates cell-cycle proteins in neurons. J. Neurovirol. 9, 300-314 (2003).
- Khan, M. Z. The chemokine CXCL12 promotes survival of postmitotic neurons by regulating Rb protein. Cell. Death. Differ. 15, 1663-1672 (2008).
- Khan, M. Z., Vaidya, A., Meucci, O. CXCL12-mediated regulation of ANP32A/Lanp, a component of the inhibitor of histone acetyl transferase (INHAT) complex, in cortical neurons. J. Neuroimmune. Pharmacol. 6, 163-170 (2011).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8, 1454-1468 (1988).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Goslin, K., Banker, G., Goslin, K., Banker, G. . Culturing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
- D’Ambrosio, J., Fatatis, A. Osteoblasts modulate Ca2+ signaling in bone-metastatic prostate and breast cancer cells. Clin. Exp. Metastasis. 26, 955-964 (2009).
