DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5: Bu yöntem şu yayında kullanılan Burada anlatılan. 1. DT40 hücre Kültür Malzemeler: Fetal sığır serumu (FBS), tavuk serumu, penisilin / streptomisin, 2 merkaptoetanol, RPMI Hücre kültürü ortamı hazırlayın:% 7 FBS eklemek,% 3 tavuk serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 10 mcM 2-merkaptoetanol RPMI medyum. DT40 hücreler steril hücre kültürü şişeleri yetiştirilen 38 ° C ve% 5 CO 2 nemlendirilmelidir inkübatör. 5 x 5 10 hücre / ml 6 yoğunluğu her geçen gün hücreleri bölme. 2 in vivo etiketleme Malzemeler: EUK, CldU Nükleotid analogları stok çözümleri hazırlayın: 5 mM ve CldU orta ve 2.5 mM IDU çözülür. Her iki çözümü de kısaca 60 Isı ° C ve nükleotid analog kadar vorteksues tamamen çözülür. 25 mcM DT40 hücreler katlanarak büyüyen bir final konsantrasyonu IDU ekleyin ve hücre süspansiyonu iyi karıştırın. 38 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri 20 dakika inkübe. Ilk etiket ile inkübasyondan sonra, nihai konsantrasyonu 250 mcM CldU eklemek ve önceki adımda açıklandığı gibi hücre tedavisi. Hücreleri buz PBS ile yıkayın ve 7.5 x 10 5 hücre / ml soğuk PBS bir konsantrasyon onları tekrar süspansiyon haline getirin. Etiketli hücreleri buz üzerinde tutun. Açıklanan etiketleme işlemi sadece bir öneridir ve özel soruları yanıtlamak için modifiye edilebilir. Deneysel tasarım hakkında daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakınız. 3. Hücre parçalama ve DNA yayılıyor Malzemeler: Cam slaytlar, lif lizis çözüm 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA ve% 0.5 SDS: fiber lizis çözüm hazırlayın <licam slayt sonuna kadar bir hücre süspansiyonu> Spot 2 ul. Hava kuru, 5 dakika veya damla hacminin kadar büyük ölçüde azalır, ancak kuru değildir. Pipetleyin 7 ul lizis hücre süspansiyonu çözüm ve çözümler karıştırmak için pipet ucu ile hafifçe karıştırın. Devam etmek için hücre erimesi için 2 dakika inkübe edin. 15 ° lifleri slayt yayılabilir izin slaytlar yatırın. Fiber çözümü slayt alt ulaştığında, kuru hava yatay olarak yerleştirin. Kuruduktan sonra ince, opak bir çizgi slayt boyunca görünür olmalıdır. Bu noktada, çizgi artık görünür olmayacak boyandıktan sonra gergin liflerin başında bir kalem ile işaretlenmiş olmalıdır. Bu işaret, daha sonra mikroskop altında lifleri bulmak için yardımcı olacaktır. 4. Immünofloresan boyaması Malzemeler: Metanol, asetik asit, HCl, PBS içinde% 5 BSA, boyama kavanoz, anti-BrdU (fare) antikor,anti-BrdU (sıçan) antikor, koyun anti-fare Cy3 antikor, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 488 antikor, Vectashield montaj orta lamelleri, oje Metanol / asetik asit (3:1), 10 dakika boyunca bir boyama kavanoz ve inkübe daldırın slaytlar. 80 dakika sonra 2.5 M HCl batırmayın distile H 2 O slaytlar, yıkayın. Yıkama 5 dakika PBS içinde üç kez slaytlar. Boyama kavanoz slaytları çıkarın ve kağıt havlu ile fazla PBS toplamak. Slaytları yatay olarak yerleştirin ve her slaytın üstüne pipetlemeyin% 5 BSA. BSA slayt üzerinde eşit biçimde yaymak ve 20 dakika boyunca inkübe slaytları bir lamel ile hafifçe örtün. 01:25 anti-BrdU (fare) ve 1:400 anti-BrdU (sıçan):% 5 BSA aşağıdaki konsantrasyonlarda primer antikorlar sulandırınız. Çıkarmak için cam slayt aşağı lamel yavaşça hareket ettirin. Kapak kayma slayt yapışıyor kuvvet uygulamayın. Lamel gevşek bir hale gelinceye kadar slayt PBS rehidrated kolaylıkla silinebilir. Bir kağıt havlu ile fazla BSA toplayın ve slaytlar yatay olarak yerleştirin. Her bir slayt üzerine primer antikor çözüm pipetleyin 50 ul. Slayt üzerinde eşit antikor çözüm yaymak ve nemlendirilmiş bir odasında 2 saat süreyle inkübe bir lamel ile tekrar örtün. Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak : Aşağıdaki konsantrasyonlarda 1:500 koyun anti-fare Cy3 ve 1:400 keçi anti-fare Alexa Fluor 488% 5 BSA sekonder antikor sulandırınız. 50 primer antikorlar için açıklandığı gibi ikincil antikor çözüm ul uygulayın. Işık ve 1 saat süreyle inkübe slaytlar koruyun. Lamelleri çıkardıktan sonra 5 dakika boyunca slayt PBS içinde üç defa yıkamak. Her bir slayt üzerine Vectashield montaj orta bir damla ekleyin ve bir lamel uygulayın. Lamelleri hafifçe basın ve kağıt havlu ile çevresinde aşırı sıvı kaldırmak. Seal lamelleri şeffaf tırnak polish ve onlara kuru sağlar. -20 ° C'de slaytlar Mağaza 5. Görüntü elde etme Malzemeler: floresan mikroskop, kamera Kalem işareti yakın bir slayt üzerine bir damla immersiyon yağı koyun ve liflerin yerini başlayın. Tipik olarak, bir ana elyaf demeti, ancak bu liflerin çok dolaşmış ve daha sonra analiz edilemez. Lifleri (Şekil 2) birbirinden açıkça ayrılmış alanlar bulmak için ana paket uzağa taşıyın. Biz sadece önyargı önlemek için tek bir renk kanalı kullanarak resimleri seçmek. Sonra, her bir zaman noktasında, konsantrasyon veya hücre hattının yaklaşık 10 fotoğraf çekmek. Ancak, resimlerin sayısı her resmi sayılır kaç lifleri bağlıdır. Bir slayt bir bölge temsilcisi fiber uzunluğu veya çoğaltma yapıları sağlamak değil, farklı fotoğraf çekmek için slayt boyunca hareket ettirin. 6. Veri analizi <p class="Jove_content"> Malzemeler: Resim analiz programı, örneğin ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) İthalat bir resim analiz programı resim. Uzunlukları ölçün lif yolları ve / veya farklı çoğaltma yapıları sayısı (Şekil 3). Sadece resmin kenarına uzatmak açıkça görülebilir ve liflerin sayısı. Biz genellikle yaklaşık 100 liflerinin uzunluğu ölçmek ve 150-200 çoğaltma yapıların sayısı ve bireysel deneyler en az üç kez tekrarlayın. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Yeni çoğaltılmış DNA antikor etiketli nükleotid analogları hatları olarak görüntülenebilir. Deneyler devam eden bir çatal bitişik kırmızı ve yeşil sinyaller (Şekil 3) olarak temsil edilir. Çift etiketleme protokolü de bize çoğaltma yapıları dört ana sınıfı tanımlamak için izin verir: 1) yeni başlanması olayları divid olabilir hücreleri ilk etiket ve ikinci etiketi ile inkübasyon sırasında ateş kökenleri ile inkübe edildi ateş var kökenleri içine ed. Eski komşu, yeşil-kırmızı-yeşil sinyaller ve yeşil hat sadece ikinci oluşur. 2) fesih olaylar bitişik kırmızı-yeşil-kırmızı sinyaller olarak tezahür eder. 3) serpiştirilmiş kökenleri dizilmesinin kökeni ile genom siteleri. Bu tür siteler, ardışık kökenleri ve sonlandırma sinyalleri oluşur. 4), deneysel tasarım bağlı olarak durdu / çökmüş çatal ya da yalnızca kırmızı bir sinyal 7 veya daha kısa bir yeşil yolu 8,9 takip eden bir kırmızı çizgi olarak tarif edilebilir. Koşullar vahşi tip DT40 hücreleri ortalama çatal hızı 0.4 mm / dak, burada açıklanan. Biz yaklaşık% 63,% 10 devam eden çatal kökenleri,% 16 durmuş çatal (kırmızı tek yollarında),% 8 sonlandırmaları ve% 3 serpiştirilmiş lifleri algılayabilir. ure 1 "/> Şekil 1 (A) karikatür sol tarafta DNA etiketleme prosedürünün ilk adımı anlatıyor: katlanarak büyüyor DT40 hücrelere IDU ekleyerek kolayca yeni sentezlenen DNA ipliklerini önde gelen ve geri kalmış dahil nükleotid analog açar. Bu spesifik antikor kullanarak görüntülendi olabilir ve mikroskop altında bakıldığında kırmızı bir çizgi olarak görünecektir. Daha sonra, bu rakam sağ tarafta gösterildiği gibi aynı prosedürü CldU tekrarlanır. Ikinci nükleotid analoğu ile inkübasyondan sonra, aktif bir çatal bitişik kırmızı-yeşil bir yolu olarak görülebilir. Ortalama lif uzunluğu nükleotid analogları inkübasyon süresi ile doğru orantılıdır. (B) parçalanan DT40 hücrelerin DNA, bir mikroskop lamı üzerine ağırlık gergin ve nükleotid analogları dahil spesifik antikorların kullanımı ve floresan mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. igure 2 "/> Şekil 2 bir temsilci floresan görüntü daha sonra her 20 dakika için IDU ve CldU etiketli yabani tip DT40 hücreleri lif gösterir . Liflerinin çoğu birbirinden ayrılır ve böylece kolayca analiz edilebilir. 10 mikron beyaz çubuğu temsil eder. Şekil 3 çift etiketleme fiber tekniği biri farklı çoğaltma yapıları arasında ayırt etmek için izin verir; 1 – aktif kopyalayan çatal, 2 – DNA replikasyonu (yeni kökeni ateş), 3 yeni siteleri – çatal sonlandırmaları (iki yakınsak çatal), 4 – serpiştirilmiş lifler (dizilmesinin kökeni siteleri) ve 5 – durmuş çatal (kırmızı sinyal).