Eendaagse Workflow Regeling bacteriële pathogenen detectie en antimicrobiële resistentie testen van Blood Cultures

DEEL I: PATHOGENEN IDENTIFICATIE 1. Monstervoorbereiding Opmerking: De hele moleculaire workflow zoals beschreven in het protocol moet worden uitgevoerd volgens de aanbevelingen voor kwaliteitsborging in de moleculaire diagnostiek 3. Voeg een 0,1 ml van bloedkweek tot 0,9 ml 0,9% NaCl in een 1,5 ml reactie buis aan een 1:10 verdunde monster te worden. (Verdun om qPCR remming te voorkomen). Centrifugeer monster op 13400 xg gedurende 5 minuten tot pellet de bacteriële DNA. Resuspendeer de bacteriële pellet in 100 ui steriel gedemineraliseerd H 2 O. Bewaar het DNA-monster bij 4 ° C tot gebruik. 2. Identificatie Assay: Real-time 16s rDNA PCR Bereid de reactiemengsels als volgt. De test bestaat uit vier afzonderlijke reacties per monster. Elk mengsel bevat 12,50 ul meestermix, 0,9 pM voorwaartse primer (5 TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3) 7 0,6 uM reverse primer (5 GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3) 8 en een panel van probes. De hoeveelheid probes voor elk van de vier afzonderlijke reacties hieronder. De eerste reactie omvat: 0,2 uM universele sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 8 0,2 uM P. aeruginosa probe (5-JOE-CCAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3-BHQ1) De tweede reactie omvat: 0,2 uM E. coli probe (5-JOE-GGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATT-3-BHQ1) 0,2 uM Pseudomonas spp. probe (5-NED-CCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTT-3-MGBNFQ) De derde reactie omvat: 0,2 uM Staphylococcus spp. probe (5-NED-AATCTTCCGCAATGGGCGAAAGC-3-MGBNFQ) 0,2 uM S. aureus probe (5-FAM-AGATGTGCACAGTTACTTACACATAT-3-BHQ1) 0,2 uM Enterococcus spp. (5-JOE-TCCTTGTTCTTCTCTAACAACAGAG-3-BHQ1) De vierde reactie omvat: 0,2 uM universele sonde (5-FAM-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3-BHQ1) 0,3 uM Streptococcus spp. probe (5-NED-CCAGAAAGGGACSGCTAACT-3-MGBNFQ) 0,2 uM S. pneumoniae probe (5-JOE-CCAAAGCCTACTATGGTTAAGCCA-3-BHQ1) Voeg steriele gedeïoniseerd H2O tot een totaal volume van 20 pl te bereiken. Voeg 20 pl van elke reactiemengsel aan de putjes van een 96-wells plaat PCR. Voeg 5 il monster in elk putje. Gebruik een zelfklevende film aan de 96-wells PCR-plaat af te dichten. Voer de plaat op de ABI PRISM 7900HT Real Time PCR-systeem met behulp van de volgende optimale thermische cycli voorwaarden: Voorverwarmen bij 50 ° C gedurende 10 min Initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 min 42 cycli van Denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 s Gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min. 3. Analyse van de resultaten Pas de drempel van de CT analyse tot 0,1 in het tabblad Analyse Instellingen. Beperk de basislijn configuraties naar Start (cyclus): 6 en End (cyclus): 15. Neem de cyclus drempel (Ct) waarde voor alle monsters. De cut-off waarde voor een PCR-resultaat als positief beschouwen kan worden ingesteld op een Ct-waarde van 35. De hoeveelheid bacteriën in bloed culturen varieerde van oktober 07 tot 10 11 CFU / ml, genereren Ct-waarden onder 35. DEEL II: antibioticum gevoeligheid TESTEN 4. Isolatie van de bacteriën uit positieve bloedkweken 9 Zuig 5 ml bouillon van een positieve bloedkweek fles en breng deze in een serum separator buis. Centrifugeer het serum separator buis bij 2000 xg gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant uit het serum afscheider buis. Transfer bacteria de gel van de buis met een steriele wattenstaafje in 0,9% zoutoplossing tot een 0,5 Mc-Farland standaard suspensie is verkregen. 5. Enten van Micro Titre platen Verdun de 0,5 McFarland suspensie in dubbel geconcentreerde Mueller Hinton II bouillon aan een suspensie van 5 x 10 5 CFU / ml te vormen. Deze suspensie aan de putjes van micro titer plaat met een selectie van antibiotica (Tabel 1). Incubeer de micro-titer platen bij 37 ° C gedurende 6 uur. Bewaar een hoeveelheid van de suspensie bij 4 ° C (als negatieve groei van controle). Na 6 uur incubatie overdracht van de inhoud van elk putje in een steriele buis evenals de krimp controlemonster werd opgeslagen bij 4 ° C. Centrifugeer de buizen bij 16000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatans, zonder verstoring van de bacteriële pellet. Resuspendeer de pellet in steriele gedemineraliseerd H <sub> 2 O. Verdun de monsters 10-voudig in een steriele gedemineraliseerd H 2 O. 6. Real-time 16s rDNA PCR 10 Bereid de PCR-mengsel als volgt: 12,50 pl iQ SYBR Green Supermix 0,5 uM voorwaartse primer 16S-1 (5-TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) 11 0,25 pM reverse primer 16S-2 (5-TACCGCGGCTGCTGGCAC-3) 11 steriel gedeïoniseerd H 2 O tot een totaal volume van 20 ul Voeg 20 pi PCR-mengsel aan de putjes van een 96-wells plaat PCR. Voeg 5 il monster in elk putje. Gebruik een zelfklevende film aan de 96-wells PCR-plaat af te dichten. Voer de plaat op de MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System, met behulp van de volgende optimale thermische cycli voorwaarden: Initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 4 min Initiële gloeien bij 65 ° C gedurende 30 s 35 cycli van Denaturatie 95 ° C gedurende 15 s Gloeien bij 60 ° C gedurende 1 min. Smelt curve analyse (van 60-95 ° C in 20 min in stappen van 0,57 ° C) 7. Analyse van de resultaten Bereken de cut-off-Ct-waarde met behulp van een van de volgende formules (afhankelijk van het soort antibioticum). In het algemeen: Cut-off Ct-waarde = Ct-waarde een positieve groei controle + 0,5 x (Ct-waarde een negatieve groei control – Ct-waarde een positieve groei controle) Piperacilline, piperacilline / tazobactam en ceftazidim bij Gram-negatieve staven, amoxicilline, oxacilline en trimethoprim / sulfamethoxazol in S.aureus, amoxicilline in Enterococcus spp. Cut-off Ct-waarde = Ct-waarde een positieve groei controle + 0,25 x (Ct-waarde een negatieve groei controle – Ct-waarde een positieve groei controle) Gebruik het monster geïncubeerd met steriel gedemineraliseerd H 2 O als een positieve groei controle. Afhankelijk van het micro-organisme, gebruik de juiste negatieve groei controle: Gram-negatieve staafjes Sample geïncubeerd met mengsel van antibiotica Enterococcus spp. Sample bewaard bij 4 ° C S.aureus Sample bewaard bij 4 ° C Bepaal de gevoeligheid (S) of weerstand (R) van de belasting voor de geteste antibioticum als volgt: Een Ct-waarde hoger dan de cut-off-Ct-waarde geeft de gevoeligheid Een Ct-waarde lager dan de cut-off-Ct-waarde geeft aan weerstand 8. Representatieve resultaten Twee modelorganismen, dat wil zeggen een Gram-negatieve E. coli en een Gram-positieve S. aureus, zijn gekozen om de gecombineerde procedure voor de detectie en identificatie van bacteriële pathogenen en het bepalen van hun antimicrobiële profiel te visualiseren. Het eerste deel van het protocol omvat het pathogeen identificatie. Spefieke probes zijn ontworpen voor de detectie van acht klinisch relevante micro-organismen. In aanwezigheid van een doel in de bacteriële paneel worden amplificatiecurves gegenereerd en Ct worden berekend (figuur 2). De cut-off waarde voor een PCR-resultaat als positief beschouwen is ingesteld op een Ct-waarde van 35. In figuur 2A wordt de identificatie van een profiel E.coli-geïnfecteerde bloedkweek weergegeven. De 16S universele sonde is opgenomen in twee afzonderlijke reactiemengsels en daarmee genereert twee versterking curven (Ct van 25,20 en 25,95). De derde signaal wordt afgeleid van de probe specifiek voor E. coli (Ct van 27,04). De identificatie van een S. aureus-geïnfecteerde bloedkweek is getoond in figuur 2B. De 16S universele sonde heeft versterking signalen van 33,35 en 33,71. De twee overige signalen zijn afgeleid van de probes specifiek voor Staphylococcus spp. en S. aureus (Ct van 32,48 en 30,59). <p class = "jove_content"> Na het eerste deel van het protocol is de causatieve microorganisme bekende en antimicrobiële profiel kan worden bepaald. figuur 3 een voorbeeld van een antibioticum gevoeligheidsbepaling amplificatie plot, die de E. coli stam die ook is aangetoond figuur 2A. Elke lijn staat voor een antibioticum dat de bacteriële monster werd geïncubeerd met. Een monster met een lage waarde Ct een monster dat groei is opgetreden in de aanwezigheid van een antibioticum, waarin tegen de geteste antibioticum. Integendeel, een hoge waarde vertegenwoordigt Ct een monster dat geen groei is opgetreden door de effectieve werking van het antibioticum, waarin gevoeligheid voor de geteste antibioticum. Tabel 1 illustreert de bepaling van de antimicrobiële profiel van de E. coli en S. aureus-isolaten. Alle Ct-waarden worden gemeld en, met behulp van de formules vermeld in het protocol tekst (7.1), twee cut-off Ct-waarden zijn berekendberekend om onderscheid te maken tussen weerstand en gevoeligheid. De stam resistent en indien het gemelde Ct lager is dan de berekende cut-off Ct waarde (en vice versa). Figuur 1. Stroomdiagram van de ziekteverwekker identificatie en antibiotica-gevoeligheid testprocedure met behulp van real-time 16S rDNA PCR. Figuur 2 Identification test:. Amplification percelen en fietsen drempelwaarden (Ct-waarden) een positieve bloedkweek wordt gedetecteerd door de universele 16S rDNA sonde, terwijl de specifieke probes worden gebruikt voor de identificatie van de causale ziekteverwekker.. A. versterking perceel van bloed-cultuur met E. coli, B. versterking perceel van bloedkweek met S. aureus, pseudoniem ae, Pseudomonals aeruginosa, uni, 16S universele sonde, Ecoli, Escherichia coli sonde; pseudoniem sp, Pseudomonas spp. probe, S. pneu, Streptococcus pneumoniae sonde; Strep sp, Streptococcus spp. sonde; Entero, Enterococcus spp. probe, S. aureus, Staphylococcus aureus sonde; Stafylokok sp, Staphylococcus spp. probe. Figuur 3. Amplification perceel van antibiotica-gevoeligheid testen van een E. coli isoleren (voorbeeld 1). Elke kromme geeft een antibioticum dat de stam werd geïncubeerd met. Een eerste signaal wordt veroorzaakt door een hoge bacteriële verontreiniging, waardoor de spanning gegroeid in de aanwezigheid van de geteste antibiotica en dus tegen het antibioticum. Late signalen blijkt dat de stam niet gegroeid in de aanwezigheid van het antibioticum, met andere woorden, het is gevoelig. <tbody> Voorbeeld 1: E. coli Voorbeeld 2: S. aureus AST Ct R / S AST Ct R / S Amoxicilline 8 mg / L 16,83 R Amoxicilline 0,25 mg / L 21,03 R Amoxicilline-clavulaanzuur 8/4 mg / L 17,36 R Oxacilline 2 mg / L 25,80 S Piperacilline 16 mg / L 16,67 R Vancomycine 2 mg / L 25,20 S Piperacilline-tazobactam 16 /4 mg / L 24,15 S Gentamicine 4 mg / L 25,86 S Ciprofloxacine 1 mg / L 29,72 S Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L 24,62 S Ceftazidim 1 mg / L 24,03 S Ceftazidim 8 mg / L 26,58 S Gentamicine 4 mg / L 29,83 S Trimethoprim-sulfamethoxazol 2/38 mg / L 27,60 S Negatieve groei controle (mengsel van antibiotica) 30,41 Negatieve groei controle (monster bewaard bij 4 ° C) 27,42 Een positieve groei controle 16,90 Een positieve groei controle 20,22 Cut-off Ct-waarde 1 * 21,76 Cut-off Ct-waarde 1 *** 23,82 Cut-off Ct-waarde 2 ** 18,75 Cut-off Ct-waarde 2 **** 22,02 * Voor amoxicilline, amoxicilline-clavulaanzuur, ciprofloxacine, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol ** Voor piperacilline, piperacilline-tazobactam, ceftazidim *** Voor vancomycine en gentamicine **** Voor amoxicilline, oxacilline en trimethoprim-sulfamethoxazol Tabel 1. Bepaling van de antibiotica-gevoeligheid testen van de twee monsters (E.coli en S.aureus). Ct waarden van de PCR-test werd gekopieerd naar deze excel bestand, die berekent de twee uiterste Ct alues ​​van de positieve en negatieve groei controle met de formules in de tekst protocol. Als een antibioticum toont een Ct-waarde lager dan de cut-off Ct waarde de stam resistent en, indien de Ct waarde hoger dan de cut-off de stam gevoelig is.