Лектин изоляции, основанные на культуре и мышь мотонейронов Эмбриональные

Для специальных реагентов: см. табл. 1. Все другие реагенты перечисленные в культуре клеток класса качества полученных из Sigma Aldrich. 1. PORN-H/laminin покрытия посуды / покровные Подготовка рабочего раствора 0,5 мг / мл Poly-DL-орнитин гидробромид (ПОРНО-H) в 150 мМ боратном буфере рН 8,35. Маточного раствора 50 мг ПОРНО / 1 мл буфера борат может быть подготовлен заранее и хранить при температуре -20 ° C. Стерилизовать стекла покровные на пылающий в 100% этанола, и пусть они воздушно-сухой. Обложка поверхности с достаточным ПОРНО-H решение в течение ночи при 4 ° C. На следующий день мыть три раза стерилизованной воды и воздушно-сухой покровные. Подготовка рабочего раствора 2,5 мкг / мл ламинин в HBSS Порции могут храниться при температуре -20 ° C. Оттепель при 4 ° С непосредственно перед применением. Обложка поверхности ПОРНО-H-покрытием покровные с ламинин решение, и пусть они инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре до использования. 2. Лектин покрытие очистки пластины Приготовить раствор из 10 мМ Трис в стерилизованной воды, рН 9,5. Добавить лектина (решения лектина (Sigma L9640) порошка в HBSS) до конечной концентрации 10 мкг / мл. Пальто поверхности 10 см клеточных культур блюдо с 8 мл лектина решение и пусть он инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть пластины в три раза с HBSS и хранить в HBSS до использования. Подготовка 30мм KCl, 0,8% (м / о) NaCl деполяризации-решения. Стерилизовать фильтрацией и хранят при комнатной температуре (RT). 3. Мотонейрона культуральной среде Оттепель лошадиной сыворотки на ночь при 4 ° С и инактивируют при 55 ° С в течение 30 мин, Алиготе в 5 мл и хранят при температуре -20 ° C. Оттепель аликвоту непосредственно перед использованием при комнатной температуре. Магазин B27-дополнение в 1 мл aliqouts при температуре -20 ° C. Оттепель B27 дополнения при комнатной температуре непосредственно перед применением. Избегайте замораживания и оттаивания. Алиготе glutamax в 0,5 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C и использовать его на 1:100. Подготовка исходного раствора 10 мкг / мл CNTF в стерилизованной воды с 0,1% БСА. Хранить при -20 ° C. Смешайте 46 мл neurobasal среде с 2,5 мл лошадиной сыворотки, 1 мл B27-дополнения и 0,5 мл glutamax непосредственно перед использованием. Добавить CNTF до конечной концентрации 10 нг / мл среды и предварительно теплой среды до 37 ° C. 4. Спинной рассечение шнур Жертва E12.5 беременной мыши и удалить эмбрионов тщательно. Добавьте достаточно РТ HBSS, чтобы полностью покрыть эмбрионов. Удалите головы и хвоста и положите эмбриона резервное копирование с оседлала конечностей. Fix эмбриона с одним щипцами и удалить внешнюю оболочку с другими щипцами. Удаление спинного мозга, прокалывая щипцов под нее и поднимите ее с пилообразный движений по обе стороны от спинного мозга. Передача изолированных спинного мозга новое блюдо с HBSS и открытый центральный канал спинного мозга на спинной стороне. Удалить спинной ганглий корень, удалив ограждающих мозговых оболочек спинного мозга. Сбор поясничного отделов спинного мозга до 6 эмбрионов в лектина пластинки в трубку Eppendorf реакции заливается 1 HBSS мл и хранят на льду до подготовки делается. 5. Обогащение мотонейронов на основе лектина очистки Примечание: Перед началом следующего шага, последние здесь готовят и prewarm среды (см. п. 3). Подготовка раствора трипсина, решая 1 г трипсина в 100 мл HBSS, хранить при температуре -20 ° С и оттаивания при температуре 4 ° C. Смешать 1 г трипсин-ингибитор с 98 мл HBSS и 2 мл 1 М HEPES рН 7,4, 1 мл аликвоты следует хранить при температуре 4 ° C. Передача трубка с спинной мозг, чтобы капот культуре клеток и осторожно удалить 700 мкл HBSS. Добавить 7,5 мкл раствора трипсина и смесь тщательно обращения трубки. Выполните trypsination в течение 8 минут при температуре 37 ° C. Остановить реакцию добавлением 30 мкл ингибитора трипсина и пипетку вверх и вниз (измельченного в порошок) тщательно 10-15 раз с 1000 мкл кончика пипетки, пока больше агрегатов ячейки видны. Повторите растирания с 20-200 мкл пипетки и соответствующие чаевые. Внесите ячейки раствор в HBSS заполненные лектина пластины и дисперсных клетки, мягко вращающиеся пластины. Держите лектина пластине в течение 60 минут при комнатной температуре на вибрации поверхности. Обложка его, чтобы избежать загрязнения. Удалить HBSS очень мягко и промыть пластины тщательно 4 раза подогретого HBSS, чтобы удалить фрагменты клеток и не привязан / одиноких клеток. Сразу же после последней промывки, добавьте 500 мкл раствора деполяризации на тарелку и дайте ему инкубировать 1 мин. Содействие отряд лектин связан клетки путем встряхивания инажав пластину. Заполнение пластина с 2 мл подогретого культуральной среде и передачи в трубке 15 мл сокола. Граф числа клеток с камеры подсчета Нойбауэр. Пластина ячейку ламинин покрытием или покровных пластин в соответствующее число в зависимости от приложения. Выполните среда обмена на 1-й день, а затем каждый второй день тщательным замены 50% от старой среды. Всегда используйте предварительно нагревают, свежеприготовленный новой среде культуры. 6. Представитель Результаты: Эмбриональные мотонейронов может быть получен из мышиных эмбрионов на E12 на E14. 2-3% от общей численности населения ячейки поясничного спинного мозга состоит из мотонейронов и, как задний корешок ганглиозных нейронов являются p75 NTR-положительные, так, важно, чтобы избавиться от этих клеток, прежде чем начать лектина основе preplating процедуры ( Для обзора см. Рисунок 1 и Рисунок 2). Во-вторых, мозговые оболочки включают сильно делящихся клеток, которые должны быть исключены, а также, поскольку они не могут быть полностью удалены от лектина основе preplating процедуры (рис. 2 и рис 3). В худшем случае, эти клетки могут перерасти культуры пластин. Представитель фотографии на рис 3B и 3D также дает представление о низкой плотности клеток после мытья процедуры были выполнены (см. шаг 5.9 протокола). Культуры эмбриональных мотонейронов мыши, как правило, поддерживается на срок до пяти-семи дней. За это время клетки установить их нейритов до максимальной длины (рис. 4). Нейритов длины сильно зависят от подложки, на пластины 8. Типичный субстрат ламинин который нанесен на ПОРНО-H покрыты блюда культуры. Мотонейронов может расти на других или менее определены субстратов, как и внеклеточных матриц, порожденных воды лизис 8. В тех случаях, субоптимального покрытия, нейритов длины и площади роста конуса снизилась и гибель клеток обычно увеличивается. Трофические поддержка играет ключевую роль для выживания эмбриональных мотонейронов мыши в культуре. Выживание первоначально покрытием клеток на день семь снизится до 10% до 20% без трофических поддержки 6. Мозг нейротрофического фактора (BDNF) и цилиарного нейротрофических факторов (CNTF) являются наиболее часто используемых факторов, но другие могут способствовать выживанию, а также [Лейкемия фактора тормозных (LIF), Cardiotrophin-1 (СТ-1), основной фактор роста фибробластов (bFGF ), инсулин-подобного фактора роста 1 (IGF-1), 9]. Рисунок 1. Поток схема подготовки эмбриональных мотонейронов мыши. Схематический рисунок иллюстрирует различные шаги для изоляции и культуре мышиных эмбриональных мотонейронов. Сокращения: SC: спинного мозга; HBSS: Хэнкс сбалансированный солевой раствор; МН: мотонейрона. Рисунок 2 Выделение поясничной части спинного мозга от E12.5 мыши:.. E12.5 эмбриона мыши. Для следующего шага, голова и хвост удаляются, а тело находится в спинном положении вверх B: Эмбрион в спинном положении вверх. Пинцет слева и справа от спинного мозга эмбриона фиксации тела в его положении. Один из щипцов впоследствии используется для резки кожи и нарезать под спинной мозг других используется для фиксации эмбриона в своей позиции C:. Изолированные спинного мозга от E12.5 эмбриона мыши. Части спинного мозга (шейный, грудной, поясничный) указаны. Спинной мозг окружен мозговые оболочки и часть спинных ганглиев корень еще приложить к ним D:. Спинного мозга продольно вырезом на спинной стороне, чтобы открыть его в сторону центрального канала E:. Мозговые оболочки на брюшной стороне в настоящее время вылетел из уплощенной спинной мозг. Примечание: В то время снял, поясничной части отмечен небольшой разрез F:. Только поясничной части спинного мозга, принимается для дальнейших процедур. Рисунок 3 Определение и изоляция Островок-позитивные клетки от поясничного спинного мозга эмбрионов мыши E12.5:.. Островок-1 / 2 антитела этикетки мотонейрона столбцы в эмбриональном поясничного спинного мозга (красный, стрелка) и Hoechst этикетки всех ядер в пределах раздела. Поперечное сечение E12.5 LUMAR спинного мозга. E12.5 эмбрионов мыши были погружения фиксировали в 4% параформальдегида в течение 6 ч, промывали 3 раза фосфатным буферным раствором и обрабатывают сахарозы в соответствии со стандартными процедурами. Cryosections 20 мкм были сделаны с помощью криостата и разделы были обработаны для окрашивания immunhistochemical соответствии со стандартными процедурами 11. Разделы изделия впоследствии помечены Hoechst для локализации клеточных ядер. Обратите внимание, чтозадний корешок ганглиозных нейронов являются Islet-1/2-positive, а также и о том, что подготовка методика исключает эту ткань части из изоляции процедура B:. Островок-1 / 2 помечены (красный, стрелка) диссоциированных поясничного клеток спинного мозга от E12. 5 эмбрионов, слева – до, так и справа – после лектина основе preplating. Клетки контрастно с Hoechst визуализировать все клеточные ядра C:. Количественная оценка Islet-1/2-positive клетки до и после лектина основе preplating D:. Nkx6.1 меченых мотонейронов от E12.5 эмбрионов после одного дня в области культуры. Клетки контрастно с Hoechst в cisualieze всех ядер. Обратите внимание, что 90% всех клетках Nkx6.1 положительным. Сокращения: SC: спинного мозга; МН: мотонейрона; DRG: спинной ганглий корня. Рисунок 4 Характеристика E12.5 мотонейронов мыши и B:.. Обогащенный изолированных E12.5 мыши поясничного спинного мотонейронов выразить p75 NTR на 0 дней в пробирке (0div) и на 2-й день в пробирке (2div). Клетки фиксировали 4% параформальдегида, а затем окрашивают в течение p75 NTR в соответствии со стандартными процедурами. Клетки контрастно использованием Hoechst для визуализации всех ядер C:. Обогащенный мотонейронов через 5 дней в пробирке (5div) на ПОРНО-H и ламинин, как культура субстратов и в присутствии окрашенных CNTF для β-III-тубулина. Обратите внимание, что клетки выросли задолго невриты и отображения типичной морфологией мотонейрона с одним дольше (разветвленные) процесса и одного или нескольких коротких процессов (аксонов и дендритов). Сокращения: MN: мотонейрона; дел: дней в лабораторных условиях. После диссоциации без Лектин основе preplating Общее количество клеток / SC Трипановый сине-позитивных клеток [%] Islet-1/2- позитивных клеток [%] 1 995,0 13,1 9,5 2 889,4 8,0 10,0 3 1.180.0 11,0 10,8 Среднее ± SD 1.021.0 ± 147,1 10,7 ± 2,6 10,1 ± 0,7 С лектина основе preplating Количество клеток после preplating / SC Трипановый сине-позитивных клеток [%] Islet-1/2- позитивных клеток [%] 1 189,6 9,9 70,5 2 168,8 3,7 76,1 3 125,0 0,0 72,5 Среднее ± SD 161,1 ± 33,0 4,5 ± 5,0 73,0 ± 2,8 Таблица 1. Резюме представителя процедуры изоляции для мышиных эмбриональных мотонейроны со сцены E12.5. Результаты 3-х различных процедурах изоляции специально для этой цели даются как общее число или процент числа ± SD. Сокращенное наименование: SC: спинного мозга; SD: стандартное отклонение. Островок-1 / 2 положительных клеток с p75 панорамирование [%] Островок-1 / 2 положительных клеток с лектина основе панорамирование [%] 92,0 ± 3,5 1 73,0 ± 2,8 Таблица 2. Сравнение Лектин основе и p75 основе 1 панорамирование номера мотонейрона клетки. Результаты представлены в процентах числа ± SD.