Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama
Summary
Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.
Abstract
Ayirt tek hücre etiketlemek için yeteneği gelişimsel biyoloji açısından önemli olmaktadır. Örneğin, nasıl hematopoetik belirlenmesi, lenf ve kan damarı soy embriyolar gelişmekte ortaya farklılaşmamış prekürsör hücrelerinin izleme kaderi haritalama ve soy gerektirir. Son zamanlarda, photoactivatable proteinler içerir: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, 8 pKindling, ve KikGR 9, 10 hücre izleme probları olarak büyük ilgi gördü. Bu proteinlerin ışığa duyarlı floresan spektrum kolayca hücre popülasyonunun bitişik olanları ayırt edilmesi için izin UV uyarma ile dönüştürülebilir. Bununla birlikte, aktif protein photoefficiency 11 izleme uzun süreli hücre sınırlayabilir. Photoactivatable proteinlerin bir alternatif olarak, kafes floresein-dekstran yaygın olarak embriyo model sistemler 7, 12-14 olarak kullanılmıştır. Geleneksel olarak, floresein-dekstran, UV excit uncage içinBir floresan lamba ev veya tek bir foton UV lazer ation kullanılır olmuştur, ancak bu tür kaynaklardan fotoaktivasyon mekansal çözünürlüğü sınırlar. İşte kader haritası, soy izleme ve tek etiketli hücreleri algılamak için bir protokol rapor. Floresein-dekstran kafesli ile enjekte edilen embriyolar tek hücrelerin bir titanyum safir femtosaniye lazer üretilen yakın-kızılötesi lazer darbeleri ile fotoaktive edilir. Bu lazer gibi bu çalışmada kullanılan LSM 510 META NLO mikroskop gibi tüm iki-foton konfokal mikroskoplar gelenektir. Biyolojik doku yakın kızılötesi radyasyon 15 şeffaf olduğundan, lazer darbeleri Seçilen odak düzlemi üzerinde veya altında hücreler uncaging olmaksızın embriyonun içinde derin odaklı olabilir. Bu nedenle, non-lineer iki-foton soğurma tek bir hücrede floresein-dekstran uncage için geometrik odak sadece indüklenir. Floresein-dekstran Uncaged içeren hücre algılamak için, biz hızla visua basit bir immünhistokimya protokolü 16 tarifaktive edilmiş hücre lize. Bu çalışmada sunulan aktivasyon ve algılama protokolü yönlü ve herhangi bir model sistem uygulanabilir.
Not: Bu protokolde kullanılan reaktifler madde sonunda ekteki tabloda bulunabilir.
Protocol
Discussion
Bu kağıt floresein-dekstran kafesli bir fotoaktivasyon dayalı tek bir hücre kaderi haritalama için çok yönlü bir yöntem açıklanır. Tek hücreler içinde floresein-dekstran kafesli bir Uncaging Zeiss LSM 510 Meta konfokal mikroskop ile birleştiğinde bir Mai Tai femtosaniye lazer iki-foton soğurma kullanılarak elde edilir. Fotoaktive hücrelerinde Uncaged floresein-dekstran basit immünohistokimya prosedürü kullanarak hızla görüntülenmiştir.
Bu protokolde kafesli floresein-dekstran fotoaktivasyon için iki foton soğurma dalga boyu 740 nm. Bu dalga boyu deneysel olarak kafese floresein-dekstran enjekte yabani-tip embriyolar photoactivating ile tespit edilmiştir. Lazer uyarma dalga boyu 600 ila 800 nm arasında değişiyordu, floresein floresan sonrası aktivasyonunun varlığı veya yokluğu niteliksel olarak tespit edilmiştir. Biz 740 nm güçlü flöresein sinyal aşağıdaki aktivasyon ürettiğini bulundu. İdeal olarak, 740 nm herkes için çalışması gerektiğinimodel sistemler, ancak biz örnek için en uygun iki foton uyarma dalgaboyu belirlemek için dalga boyu bir dizi test öneriyoruz.
Her iki foton uyarma dalgaboyu biz de ortalama lazer gücü zengindir test için kafesli olarak floresein-dekstran, yabani-tip embriyolar enjekte. 740 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu için, 47 arasında bir ortalama lazer güç mW ortalama lazer güçler düşürmek ile karşılaştırıldığında, aktif bölge de daha kuvvetli bir fluoresein sinyal üretti. Yükseköğretim ortalama lazer güçler güçlü floresan sinyalleri üretmek, ancak doku kaynaklı ablasyonu vermedi. Femtosaniye lazer darbeleri ablasyonu biyolojik doku 15 verimli olduğundan, biz doku ablasyonu önler fotoaktivasyon için eşik ortalama lazer gücünün belirlenmesinde öneririz.
İki foton soğurma küçük bir etkileşim hacmi içinde gerçekleşir. Kafesli floresein-dekstran uygun aktivasyon sağlamak için, hücrenin uygun odak noktasına getirilmelidir. Thprotokolü yukarıdaki e, GFP pozitif hücreler aynı anda hücre odak onaylamak için beyaz ışık altında görüntülendi. Bu nedenle, beyaz ışık toplama diğer kanallarına ek olarak tavsiye edilir. Hücre odak onayladıktan sonra, bizim protokolü aktif hücre büyütme göstermektedir. 50 ila 70 arasında bir büyütme faktörü tavsiye edilmektedir, bununla birlikte, bu değer hücre seçilmiş büyüklüğüne bağlıdır. Zum arttırılması bitişik hücrelerin aktive olan hücre izole etme, ve iki-fotonlu aktivasyonu için tarama alanı sınırlar. İdeal olarak, tarama alanının hücre geniş bir alanı kapsamalıdır.
Tek aktif hücrelerin saptanması plan boyama minimal olmasını gerektirir. Yukarıdaki İmmuno protokolde bu örnek 5 ila 6 saat (adım 4.13) için tampon engelleme engellenmiş olduğunu önemlidir. NBT / BCIP ile geliştirirken, Uncaged floresein-dekstran 10 ila 20 dakika içinde görünür hale gelmelidir. Arka plan boyama güçlü ise, anti-kaldırmak için uzun bir engelleme süre ve ek yıkar öneririzvücut (adım 4.17).
Şekiller 1 ve 2 fotoaktivasyon ve İmmuno temsili sonuçlar sağlar. Şekil 1, erken 1 – 2-hücreli aşamada yabani-tip embriyolar floresein-dekstran kafesli enjekte edildi. Embriyolar orta somitogenesis kaldırdı ve yanal yönde düşük erime agaroz monte edildi. Şekil 1. (a, b) fotoaktivasyon önce Aydınlık ve embriyo floresan görüntüler betimliyor. Embriyo Uncaged kalmıştır dair kanıt Şekil 1 (b) 'de floresan floresan olmaması ile ortaya konmuştur. Bir somite içinde küçük bir bölge 47 ortalama bir lazer güç mW, Şekil 1 (; ok c) kullanarak 31 saniye için 740 nm dalga boyu ile aktive edildi. Floresein-dekstran Post-aktivasyon, iki-fotonlu uncaging olarak etkin alan, Şekil 1 (; ok d) floresan ile gösterilen oluştu. Somitic dokusu bozulmadan, Şekil 1 (c) kalmıştır Aktivasyon, lazer ablasyon eşlik etmemişti. Şekil 2, Uncaged florun İmmuno göstermektedir -dekstran escein. 10 somite aşama embriyo yan plaka mezoderm içinde küçük bir bölge Şekil 1 'de belirtildiği gibi aynı lazer parametreleri kullanarak fotoaktive edildi. Embriyo kaldırdı ve 4.20 arasındaki adımları 4.1 kullanılarak işlendi. Şekil 2 bulur ok aktif bölge olarak mavi çökelti birikimi ile gösterilir. Sadece aktif konum açıkça arka plan boyama müdahale olmadan tespit edilir.
Çözeltilerin Hazırlanması:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 X PBS
2 g BSA
10 mL% 20 Tween
10 x PBS (1 L)
80 g NaCl
2 g KCI
6.1 g Na 2 HPO 4
1.9 g KH 2 PO 4
1 L GKD 2 O
7.3 pH
% 4 paraformaldehit (160 mL)
% 32 Paraformaldehyde (iki 10 ml flakon)
8 ml 20 X PBS
132 ml GKD 2 O
1 mL 5 M NaCl
2,5 ml 1 M MgCl2
5 mL 1 M Tris, pH 9.5
250 ul% 20 Tween
41.25 ml GKD 2 O
Antikor çözeltisi (1 numune için)
5.5 mcL Aseton tozu
40 ul PBT
0.8 mcL LS
0.1 mcL Anti-florosin AP-antikor
% 2 LS (1 numune için 360 mcL)
7.2 mcL% 100 LS
352,8 mcL PBT
1 X Danieau ortamı (1 L) ‡
11.6 ml 5 M NaCI
700 mcL 1 M KCl
400 ul 1 M MgSO4
600 ul 1 M Ca (NO 3) 2
5 mL 1 M HEPES
1 L GKD 2 O
pH 7,6 ayarlamak
‡ Danieau dechorionated zebrafish embriyolar yetiştirme için ideal bir tuz bir çözümdür. Diğer medya kullanılıyor olabilir, bunlar pro ile izotonik çözeltiler şartıylaPerly ozmolarite (zebrafish için ~ 300 mOsm)
NBT stok (1 mL)
50 mg Nitro Blue Tetrazolium
0.7 ml dimetil formamid anhidrid
0.3 ml GKD 2 O
BCIP stok (1 mL)
50 mg 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat
1 ml dimetil formamid anhidrid
NBT / BCIP gelişmekte çözümü
1 mL AP tampon
4.5 mcL NBT stok
3.5 mcL BCIP stok
Aseton tozu
- 20 erişkin balık seçin ve sıvı azot içinde bunları dondurmak.
- Bir harçla dondurulmuş balık Grind ve toz pestle.
- Bir 50 mL konik bir tüp içine balık tozu aktarın.
- % 100 aseton ile konik boru doldurun. Vorteks tüpü.
- 10 dakika için maksimum devirde tüp Spin. Süpernatantı atın.
- % 100 aseton pelet 3 kez yıkayın ve 10 dakika için maksimum devirde tüp dönerler. By son yıkama süpernatantı açıkça görünmelidir.
- Tekrar pelet% 100 aseton ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bekletin. Ince parçacıkların süspansiyon kalır ise daha yoğun parçacıklar, razı olacak.
- Yeni bir tüp içine ince parçacıklar süzün. Tablet toz ayrı tüpleri içine çözelti ve -20 ° C'de saklayın
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz kafesli floresein-dekstran sentezi protokolü sağlayan J. Chen ederim. Bu araştırma Dimes ödülü 5-FY09-78, Amerikan Kalp Derneği ödülünü 09BGIA2090075 yılının Mart tarafından desteklenen ve SS NIH / NHLBI ödülü R01 HL107369-01 özel yaptığı mikroskopi yardım için C. Closson için teşekkür ederim. Edildi
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Referencias
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 .
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
