Sola célula de mapeado de destino en el pez cebra
Summary
Se describe un método para photoactivate células individuales que contienen una proteína fluorescente enjaulado con la absorción de dos fotones de un Ti: Zafiro de femtosegundos oscilador láser. Para asignar el destino de la célula fotoactivado, inmunohistoquímica se usa. Esta técnica se puede aplicar a cualquier tipo de célula.
Abstract
La capacidad de etiquetar diferencialmente las células individuales tiene implicaciones importantes en la biología del desarrollo. Por ejemplo, la determinación de cómo hematopoyéticas, linajes linfáticos y los vasos sanguíneos surgen en embriones en desarrollo requiere la asignación destino y el linaje de localización de las células precursoras no diferenciadas. Recientemente, las proteínas fotoactivables que incluyen: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, Kaede 4-7, pKindling 8 y KikGR 9, 10 han recibido un gran interés como sondas de rastreo celular. El espectro de fluorescencia de estas proteínas fotosensibles se puede convertir fácilmente con excitación UV, lo que permite a una población de células que se distingue de las adyacentes. Sin embargo, el photoefficiency de la proteína activada puede limitar a largo plazo de células de seguimiento 11. Como una alternativa a las proteínas fotoactivables, enjaulados con fluoresceína dextrano ha sido ampliamente utilizado en sistemas modelo embrión 7, 12-14. Tradicionalmente, para desenjaular fluoresceína dextrano, excitación UV de una casa de la lámpara fluorescente o un láser UV solo fotón se ha utilizado, sin embargo, dichas fuentes límite de la resolución espacial de fotoactivación. Aquí se presenta un protocolo de mapa del destino, traza el linaje, y detectar solo las células marcadas. Las células individuales en embriones inyectados con fluoresceína enjaulado-dextrano se fotoactivado con pulsos láser en el infrarrojo cercano producido a partir de un láser de femtosegundo de titanio zafiro. Este láser es habitual en todos los microscopios confocal de dos fotones, como el microscopio LSM 510 META NLO utilizado en este trabajo. Dado que el tejido biológico es transparente a la radiación en el infrarrojo cercano, 15 de los pulsos del láser puede ser enfocado en lo profundo de las células del embrión sin uncaging por encima o por debajo del plano focal seleccionada. Por lo tanto, no lineal, la absorción de dos fotones es inducido sólo en el centro geométrico de desenjaular fluoresceína dextrano en una sola célula. Para detectar la celda que contiene uncaged fluoresceína dextrano, se describe un protocolo de inmunohistoquímica sencilla de 16 a visualizar rápidamente la celda activa. El protocolo de activación y detección presentados en este trabajo es versátil y puede aplicarse a cualquier modelo de sistema.
Nota: Los reactivos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la tabla adjunta al final del artículo.
Protocol
Discussion
Este artículo describe un método versátil para la asignación de un solo destino celular basado en la fotoactivación de jaulas con fluoresceína dextrano. Uncaging de jaulas con fluoresceína dextrano en las células individuales se logra mediante la absorción de dos fotones de un láser de femtosegundo Mai Tai, junto con el microscopio Zeiss LSM 510 META confocal. Uncaged fluoresceína dextrano en las células fotoactivado es rápidamente visualizado mediante un procedimiento de inmunohistoquímica simple.
En este protocolo la longitud de onda de absorción de dos fotones para la fotoactivación de la jaula con fluoresceína dextrano es de 740 nm. Esta longitud de onda se determinó experimentalmente por photoactivating enjaulados fluoresceína dextrano inyecta embriones de tipo salvaje. La longitud de onda de excitación láser se varió desde 600 hasta 800 nm, y la presencia o ausencia de fluoresceína fluorescencia después de la activación se determinó cualitativamente. Encontramos que 740 nm produce la mayor activación de la señal de fluoresceína siguientes. Lo ideal es 740 nm debe trabajar para todos los sistemas modelo, sin embargo, le recomendamos probar una amplia gama de longitudes de onda para determinar el óptimo de dos fotones de longitud de onda de excitación de la muestra.
En jaulas con fluoresceína dextrano embriones de tipo salvaje se inyecta, para cada longitud de onda de excitación de dos fotones prueba también varía la potencia del láser promedio. Para una longitud de onda de excitación de 740 nm, un láser de potencia media de 47 mW produce una señal fuerte de fluoresceína en la región activa en comparación con el promedio más bajo poderes láser. Mayores potencias de láser promedio no producen señales más fuertes de fluoresceína, pero la ablación inducida del tejido. Puesto que los pulsos láser de femtosegundos son eficientes en la ablación de los tejidos biológicos 15, se recomienda la determinación de la media del umbral de potencia láser para la fotoactivación que evita la ablación del tejido.
Absorción de dos fotones se produce dentro de un volumen pequeño de interacción. Para garantizar la correcta activación del enjaulados fluoresceína dextrano, la célula debe ser llevado a un enfoque correcto. En el protocolo anterior, las células GFP positivas fueron fotografiadas simultáneamente con luz blanca para confirmar el enfoque de la célula. Por lo tanto, la adquisición de la luz blanca, además de otros canales es aconsejable. Después de confirmar el enfoque celular, el protocolo sugiere aumento de la celda activa. Un factor de zoom de 50 a 70 se sugiere, sin embargo, este valor depende del tamaño de la celda seleccionada. Aumentar el zoom aislados de la celda activa de las células adyacentes, y los límites de la zona de exploración de dos fotones de activación. Lo ideal sería que el área de exploración debe cubrir un área grande de la célula.
La detección de células activadas solo requiere que la tinción de fondo es mínimo. En el protocolo de inmunodetección por encima de ella es importante que la muestra está bloqueada en tampón de bloqueo durante 5 a 6 horas (paso 4,13). Cuando se desarrolla con NBT / BCIP, uncaged fluoresceína dextrano se hacen visibles en 10 a 20 minutos. Si la tinción de fondo es fuerte, se aconseja un tiempo más largo bloqueo y lavados adicionales para eliminar los anticuerpos (paso 4,17).
Las figuras 1 y 2 proporcionan resultados representativos de la foto-y la inmunodetección. En la figura 1, los primeros 1 – 2 de células de tipo salvaje embriones fueron inyectados con la etapa enjaulados fluoresceína dextrano. Los embriones se plantearon a mediados somitogenesis y montado en agarosa de baja fusión en la orientación lateral. Figura 1 (a, b) representar claro y las imágenes fluorescentes del embrión antes de la fotoactivación. La evidencia de que el embrión se mantuvo uncaged se demuestra por la ausencia de fluorescencia de la fluoresceína en la Figura 1 (b). Una pequeña región dentro de un somite se activó con una longitud de onda de 740 nm durante 31 segundos utilizando un láser de potencia media de 47 mW, la Figura 1 (c, flecha). Después de la activación de dos fotones uncaging de fluoresceína-dextrano se produjo, como se muestra por la fluorescencia de la zona activa, la Figura 1 (d, flecha). La activación no fue acompañado por la ablación por láser, como el tejido somitic mantuvo intacta la figura, 1 (c). La figura 2 muestra la inmunodetección de uncaged fluoresceína dextrano. Una pequeña región en el mesodermo de la placa lateral de un embrión en su fase de 10 somitas se fotoactivado utilizando los parámetros del láser que se mencionan en la Figura 1. El embrión fue levantado y procesados utilizando los pasos 4.1 a 4.20. La flecha en la Figura 2 localiza en la región activa, según lo indicado por la acumulación de precipitado de color azul. Sólo la ubicación activa se detecta claramente, sin interferir la tinción de fondo.
Preparación de las soluciones:
1 X PBT (1 L)
100 ml 10 x PBS
2 g de BSA
10 ml de 20% de Tween
10 X PBS (1 L)
80 g de NaCl
2 g KCl
6,1 g de Na 2 HPO 4
1,9 g KH 2 PO 4
ddH2O a 1 L
pH a 7.3
Paraformaldehído al 4% (160 ml)
32% de paraformaldehído (dos viales de 10 ml)
8 de 20 ml X PBS
132 ml ddH2O
1 ml de 5 M NaCl
2,5 ml de 1 M de MgCl2
5 ml de 1 M Tris pH 9,5
250 l de Tween 20%
41,25 mL ddH2O
Solución de anticuerpos (para una muestra)
5,5 l de acetona en polvo
40 l PBT
LS 0.8 l
0,1 l anti-fluoresceína anticuerpos AP
2% LS (360 l de una muestra)
LS 7.2 l 100%
352,8 l PBT
1 X Danieau los medios de comunicación (1 l) ‡
11,6 ml de 5 M NaCl
700 l 1 M KCl
400 l 1 M MgSO 4
600 l 1 M de Ca (NO 3) 2
5 ml de 1 M HEPES
ddH2O a 1 L
pH ajustar a 7,6
‡ Danieau es una solución de sal ideales para la cría de embriones de pez cebra dechorionated. Otros medios de comunicación se pueden utilizar, siempre que sean isotónicas con la adecuada osmolaridad (~ 300 mOsm para el pez cebra)
NBT de valores (1 ml)
50 mg nitro azul tetrazolio
0,7 ml de anhídrido dimetilformamida
0,3 ml ddH2O
BCIP de valores (1 ml)
50 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
1 mL de anhídrido dimetilformamida
NBT / BCIP solución de desarrollo
1 ml de buffer AP
4,5 l de archivo NBT
3,5 l de valores BCIP
Acetona en polvo
- Seleccionar 20 peces adultos y congelarlos en nitrógeno líquido.
- Moler el pescado congelado con un mortero hasta obtener un polvo.
- Transferencia de la harina de pescado en un tubo cónico de 50 ml.
- Llenar el tubo cónico con acetona al 100%. El tubo de vórtice.
- Girar el tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Eliminar el sobrenadante.
- Lavar el sedimento otras 3 veces en acetona al 100% y el giro del tubo a un máximo de rpm durante 10 minutos. Por el último lavado el sobrenadante debe ser transparente.
- Añadir 100% de acetona a la bolita de nuevo y dejar el tubo a temperatura ambiente. Las partículas más densas se instalará, mientras que las partículas más finas que permanecen en suspensión.
- Decantar las partículas finas en un nuevo tubo. Alícuota de la solución de polvo en tubos separados y almacenarlos a -20 ° C.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a J. Chen para proporcionar la jaula con fluoresceína dextrano protocolo de síntesis. Esta investigación fue financiada por March of Dimes premio 5-AF09-78, la American Heart premio de la Asociación 09BGIA2090075, y el premio del NIH / NHLBI HL107369 R01-01 a SS Un agradecimiento especial a C. Closson por su ayuda de microscopía.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Referencias
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