תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה
Summary
השיטה מתוארת על photoactivate תאים בודדים המכיל חלבון פלואורסצנטי בכלוב באמצעות שני פוטונים קליטה מתוך טי: לייזר ספיר מתנד femtosecond. כדי למפות גורל התא photoactivated, אימונוהיסטוכימיה משמשת. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת לכל סוג תא.
Abstract
היכולת דיפרנציאלי תווית תאים בודדים יש השלכות חשובות בביולוגיה התפתחותית. למשל, לקבוע כיצד היווצרות הדם, הלימפה, כלי הדם שושלות להתעורר עוברים לפתח מחייב מיפוי גורל השושלת העתקה של תאים מבשר מובחן. לאחרונה, חלבונים photoactivatable הכוללים: Eos 1, 2, 3 PAmCherry, קאךה 4-7, pKindling 8, KikGR 9, 10 קיבלו אינטרס רחב כמו בדיקות מעקב התא. ספקטרום הקרינה של החלבונים האלה רגישים ניתן להמיר בקלות עם עירור UV, המאפשר אוכלוסייה של תאים כדי להבחין בין אלה סמוכים. עם זאת, photoefficiency של החלבון הפעיל עלול להגביל בטווח הארוך מעקב תא 11. כחלופה חלבונים photoactivatable, בכלוב והעמסת-dextran כבר בשימוש נרחב במודל מערכות העובר 7, 12-14. באופן מסורתי, כדי uncage והעמסת-dextran, עירור UV מבית המנורה הקרינה או לייזר יחיד UV פוטון נעשה שימוש, אולם מקורות כגון להגביל את הרזולוציה המרחבית של photoactivation. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפת גורל, זכר השושלת, וכדי לזהות תאים תווית אחת. תאים יחיד בעוברים הזריקו בכלוב והעמסת-dextran הם photoactivated עם קרוב אינפרא אדום פעימות לייזר המופק לייזר femtosecond טיטניום ספיר. לייזר זה נהוג בכל שני הפוטונים מיקרוסקופים confocal כמו מיקרוסקופ 510 LSM NLO META בשימוש בנייר זה. מאז רקמות ביולוגיות שקופה קרינה אינפרא אדום הקרוב 15, קטניות הלייזר יכול להיות ממוקד עמוק ללא משחררות רפרוף תאים מעל או מתחת למישור המוקד נבחרים בתוך העובר. לכן, שאינו ליניארי שני הפוטונים קליטה מושרה רק במוקד גיאומטריים uncage והעמסת-dextran בתא בודד. כדי לזהות את התא המכיל שברחה מכלוב והעמסת-dextran, אנו מתארים פרוטוקול פשוט אימונוהיסטוכימיה 16 במהירות כדי להמחיש את התא הפעיל. פרוטוקול הפעלה וזיהוי המוצג במאמר זה הוא צדדי יכול להיות מיושם על כל מערכת מודל.
הערה: חומרים כימיים המשמשים פרוטוקול זה ניתן למצוא בטבלה המצורפת בסוף המאמר.
Protocol
Discussion
מאמר זה מתאר שיטה צדדי למיפוי תא בודד גורל בהתבסס על photoactivation של בכלוב והעמסת-dextran. משחררות רפרוף של בכלוב והעמסת-dextran בתאים בודדים מושגת באמצעות שני פוטונים הקליטה של לייזר femtosecond מאי טאי מצמידים את המיקרוסקופ LSM 510 META Zeiss confocal. שברחה מכלוב והעמסת-dextran בתאים photoactivated הוא מדמיין במהירות באמצעות הליך פשוט אימונוהיסטוכימיה.
בפרוטוקול זה הגל שני הפוטונים קליטה של photoactivation בכלוב והעמסת-dextran הוא 740 ננומטר. אורך גל זה נקבע באופן ניסיוני על ידי photoactivating בכלוב והעמסת-dextran עוברים wildtype מוזרק. גל עירור הלייזר היתה מגוונת 600-800 ננומטר, ועל נוכחות או העדר והעמסת הקרינה שלאחר ההפעלה נקבע איכותית. מצאנו כי 740 ננומטר המיוצר ההפעלה החזקה והעמסת האות הבאה. באופן אידיאלי, 740 ננומטר צריך לעבוד עבור כל מערכות המודל, אך אנו מייעצים בדיקות מגוון רחב של אורכי גל כדי לקבוע את אורך הגל האופטימלי שני הפוטונים עירור למדגם שלך.
בשנת עוברים בכלוב והעמסת-dextran wildtype מוזרק, עבור גל שני הפוטונים כל עירור נבדק גם אנחנו מגוונים את הכוח לייזר הממוצע. עבור גל עירור של 740 ננומטר, כוח לייזר ממוצע של 47 mW המיוצר אות והעמסת חזקה על האזור הפעיל בהשוואה נמוך סמכויות לייזר הממוצע. גבוהה סמכויות לייזר הממוצע לא לייצר אותות והעמסת חזק, אבל אבלציה המושרה של הרקמה. מאז לייזר פולסים femtosecond יעילים ב ablating רקמות ביולוגיות 15, אנו ממליצים על קביעת סף ממוצע לייזר כוח photoactivation כי ימנע אבלציה רקמות.
שני הפוטונים הקליטה מתרחשת בתוך אינטראקציה נפח קטן. כדי להבטיח הפעלה ראויה של בכלוב והעמסת-dextran, התא חייב להיות מובא אל המוקד הנכון. בפרוטוקול לעיל, תאים GFP חיובית היו צילמו בו זמנית תחת אור לבן כדי לאשר להתמקד התא. לכן, רכישת אור לבן, בנוסף לערוצים אחרים מומלץ. לאחר אישור להתמקד התא, פרוטוקול שלנו מציע מגדלת התא הפעיל. גורם זום של 50-70 הוא הציע, עם זאת, ערך זה תלוי בגודל של התא הנבחר. הגדלת זום מבודד את התא הפעיל של תאים סמוכים, ומגביל את אזור הסריקה להפעלת שני הפוטונים. באופן אידיאלי, לסרוק את האזור צריך לכסות שטח גדול של התא.
איתור של תאים מופעל יחיד דורש כי מכתים רקע להיות מינימלית. בפרוטוקול immunodetection לעיל חשוב כי המדגם הוא חסום חוסם חיץ במשך 5 עד 6 שעות (שלב 4.13). בעת פיתוח עם NBT / BCIP, שברחה מכלוב והעמסת-dextran צריך להיות גלוי ב 10 עד 20 דקות. אם מכתים רקע חזק, אנו ממליצים זמן ארוך יותר חסימת ושוטף נוספת כדי להסיר את הנוגדן (שלב 4.17).
איורים 1 ו -2 לספק תוצאות נציג photoactivation ו immunodetection. באיור 1, מוקדם 1 – ל 2 תאים בשלב עוברי wildtype הוזרקו בכלוב והעמסת-dextran. עוברים הועלו על somitogenesis באמצע ועלה נמוך ההיתוך agarose בכיוון לרוחב. איור 1 (a, b) מתארים brightfield ותמונות הניאון של העובר לפני photoactivation. ראיות כי העובר נשאר שברחה מכלוב באה לידי ביטוי בהעדר והעמסת הקרינה באיור 1 (ב). אזור קטן בתוך somite הופעל עם אורך גל של 740 ננומטר במשך 31 שניות באמצעות כוח לייזר ממוצע של 47 mW, איור 1 (ג; החץ). לאחר ההפעלה, שני הפוטונים משחררות רפרוף של והעמסת-dextran התרחשו כפי שמוצג על ידי הקרינה מאזור מופעל, איור 1 (ד; החץ). הפעלה לא לוותה אבלציה לייזר, כמו רקמת somitic איור נשאר שלם, 1 (ג). איור 2 מדגים את immunodetection שברחה מכלוב של והעמסת-dextran. אזור קטן והמזודרם את הצלחת רוחבי של העובר 10-somite שלב היה photoactivated באמצעות פרמטרים לייזר זהה כאמור באיור 1. העובר גדל ומעובד באמצעות צעדים 4.1 עד 4.20. החץ באיור 2 מאתרת באזור הפעיל, כפי שצוין על ידי הצטברות של משקע כחול. רק המיקום מופעל מזוהה בבירור בלי להתערב מכתים רקע.
ההכנה של פתרונות:
1 X PBT (1 L)
100 מ"ל 10 X PBS
2 גרם BSA
10 מ"ל 20% Tween
10 X PBS (1 L)
80 גרם NaCl
2 גרם KCl
6.1 גרם Na 2 HPO 4
1.9 גרם KH 2 PO 4
DDH 2 O ל L 1
עד 7.3 pH
Paraformaldehyde 4% (160 מ"ל)
Paraformaldehyde 32% (שני בקבוקונים 10 מ"ל)
8 X 20 מ"ל PBS
132 מ"ל DDH 2 O
1 מ"ל 5 M NaCl
2.5 מ"ל 1 M MgCl 2
5 מ"ל 1 M טריס pH 9.5
250 Tween 20% μL
41.25 מ"ל DDH 2 O
פתרון נוגדן (למדגם 1)
5.5 אצטון μL אבקת
40 μL PBT
0.8 LS μL
0.1 μL נוגדן Anti-והעמסת-AP
LS 2% (360 μL למדגם 1)
7.2 LS 100% μL
352.8 μL PBT
1 X Danieau מדיה (1 L) ‡
11.6 mL 5 M NaCl
700 μL 1 M KCl
400 μL 1 M MgSO 4
600 μL 1 M Ca (NO 3) 2
5 מ"ל 1 M HEPES
DDH 2 O ל L 1
pH להסתגל 7.6
‡ Danieau הוא פתרון אידיאלי עבור מלח גידול עוברי דג הזברה dechorionated. מדיה אחרים עשויים לשמש, בתנאי שהם פתרונות איזוטוני עם osmolarity כראוי (~ 300 mOsm עבור דג הזברה)
NBT מניות (1 מ"ל)
50 מ"ג Nitro כחול Tetrazolium
0.7 מ"ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל
0.3 מ"ל DDH 2 O
BCIP מניות (1 מ"ל)
50 מ"ג 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט
1 מ"ל אנהידריד לפוראמיד דימתיל
NBT / BCIP בפיתוח פתרון
1 מ"ל AP חיץ
4.5 NBT μL מניות
3.5 BCIP μL מניות
אצטון אבקת
- בחר 20 דגים בוגרים להקפיא אותם בחנקן נוזלי.
- טוחנים את הדג הקפוא עם במכתש ועלי לאבקה.
- מעבירים את אבקת דגים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- מלאו את צינור חרוטי עם אצטון 100%. וורטקס את הצינורית.
- ספין התחתית מקסימום סל"ד במשך 10 דקות. בטל supernatant.
- שטפו את גלולה אחרת 3 פעמים אצטון 100% ספין התחתית מקסימום סל"ד במשך 10 דקות. עד לשטוף האחרון supernatant אמור להופיע ברור.
- הוסף אצטון 100% עד שוב את הכדור ולתת הצינור לעמוד בטמפרטורת החדר. החלקיקים צפופים יותר יהיה להסתפק, ואילו חלקיקי עדין יישארו ההשעיה.
- למזוג חלקיקים לתוך צינור חדש. Aliquot אבקת פתרון לתוך צינורות נפרדים ולאחסן אותם ב -20 ° C.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ג'יי צ'ן מתן בכלוב והעמסת-dextran פרוטוקול סינתזה. מחקר זה נתמך על ידי מצעד הפרוטות פרס 5-78-FY09, איגוד הלב האמריקאי הפרס 09BGIA2090075, ואת הפרס NIH / NHLBI HL107369 R01-01 אס תודה מיוחדת ג Closson לסיוע במיקרוסקופ שלו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Referencias
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 .
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
