Single Cell Fate Mapping in de zebravis

1. Synthese van gekooide fluoresceïne-dextran (overgenomen van Ref. 14) Bereid een 0,1 M oplossing van natriumboraat verdund in DDH 2 O. Maatregel 4 mg van 10 kDa aminodextran en voeg deze toe aan de CMNB-kooien fluoresceïne buis. Voeg 500 ul van de bereide natriumboraatoplossing (stap 1.1) naar de CMNB-kooien fluoresceïne buis. Cap de buis en vortex gedurende 30 seconden om het mengsel te ontbinden. Laat het mengsel een nacht reageren op een nutator bij kamertemperatuur. Bedek de buis met metaalfolie om de blootstelling van het mengsel aan het omgevingslicht te voorkomen. Verkrijgen van een Zeba ontzouten spin-kolom en draai de onderste dop. Markeer een stip op de kolom, die zal worden gebruikt te oriënteren in de kolom bij het centrifugeren. Plaats de kolom in een 15 ml conische Falcon buis. Opmerking: De oplossing in de spin kolom is kolom buffer. Draai de dop op de ontzouten spin-kolom. Plaats de 15 ml conische Falcon buis die het ontzouten spin-kolom huizen in een centrifuge. Orient de spin kolom met de gemarkeerde stip (stap 1.4) naar het midden van de centrifuge rotor. Centrifugeer de buis bij 1000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren, verwijder het ontzouten spin-kolom uit de Falcon buis. Gooi zowel de verzamelde doorstroming en de 15 ml conische buis. Verkrijgen van een nieuwe 15 ml conische Falcon tube, en plaats het ontzouten spin-kolom in de nieuwe Falcon buis. Opmerking: Na het centrifugeren, de kolom harsbed moeten verschijnen verdicht. Direct gebruik van de kolom. Verkrijgen van de gereageerde mengsel (gekooid fluoresceïne-dextran) in stap 1.3. Verwijder de dop van de spin kolom en zuig de gereageerde mengsel en langzaam toe te passen op het midden van het ontzouten spin-kolom. Na het aanbrengen van de gereageerde mengsel, vervang dan de dop op de spin kolom. Plaats de Falcon buis die het ontzouten spin-kolom huizen in een centrifuge. Zoals gedaan in stap 1.5, oriënteren de spin kolom met de gemarkeerde stip naar het midden van de centrifuge rotor. Centrifugeer de buis bij 1000 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Na het centrifugeren, zal een geel mengsel (gekooid fluoresceïne-dextran) worden verzameld (ongeveer 400 pi) in de 15 ml Falcon buis. Breng de gekooide fluoresceïne-dextran mengsel aan een 1,5 mL microcentrifugebuis. Direct betrekking hebben op de buis met metaalfolie om de blootstelling van het mengsel aan het omgevingslicht te voorkomen. Lyophilize de gekooide fluoresceïne-dextran mengsel in een speedvac. Vriesdroging van 350 pi duurt ongeveer 4 uur. Na volledige vriesdrogen, resuspendeer de poeder (ongeveer 3 mg) in DDH 2 O tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 1% w / v. Meng door kort vortexen om het poeder op te schorten. Aliquot de gekooide fluoresceïne-dextran in afzonderlijke metalen folie bedekt buizen, en bewaar ze bij -20 ° C. 2. Het oogsten van embryo's en micro-injectie van gekooide fluoresceïne-dextran * Deze procedure maakt gebruik van de zebravis als het dier modelsysteem. Op de dag voor injecties, opgericht zebravis kruis ofwel 01u01 man-naar-vrouw of 2:1 man-naar-vrouw in kweekbakken met verdeelschotten. De volgende morgen veranderen de kweekbak water en verwijder de verdelers. Onmiddellijk voor te bereiden een 5 il 1 / 10 verdunde oplossing van gekooide fluoresceïne-dextran in een van beide een X Danieau media (zie Voorbereiding van Solutions), of DDH 2 O. Bedek de werkoplossing buis met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Pipetteer de voorbereide gekooide fluoresceïne-dextran-oplossing (stap 2.2) in de naald. Voor het snijden van de naald tip om een ​​passende omvang onder de dissectie microscoop, een stukje doorzichtig geel filter voor het witte lichtbron. De gele filter voorkomt dat spontane uncaging van de fluoresceïne-dextran tijdens de injecties. Als je door het oculair oculair, moet de lichtbron verschijnen geel. Verzamel embryo's en pipet ze in een micro-injectie mal lade. Stel de micro-injectie tijd om nL te leveren 3 tot 4 van gekooide fluoresceïne-dextran. Onder de dissectie microscoop, oriënteren de embryo's met een pincet en injecteer (3 tot 4 nL) gekooid fluoresceïne-dextran in de basis van de blastomeer cellen (blastomeer-dooier-interface). Het embryo podium voor injectie dient te worden 1 – tot 2-cellig stadium. Na de injectie, verwijder de embryo's uit de micro-injectie vorm lade en plaats ze in een schone petrischaaltje met verse vis water. Methyleenblauw kunnen worden toegevoegd aan de vis water om schimmelgroei te voorkomen dat bij een uiteindelijke concentratie van ten 0,02% w / v. Dek de petrischaal met metalen folie om te voorkomen dat uncaging van de geïnjecteerde gekooide fluoresceïne-dextran. Verhoog de geïnjecteerde embryo's om een ​​stadium waarin de cellen van belang moeten worden gefotoactiveerd. Voor fotoactivatie, bereiden een 0,6% laagsmeltende agarose oplossing in DDH 2 O. Afhankelijk van het embryo podium, tricaïne (MS222) kunnen worden toegevoegd aan de lage smeltpunt agarose. Om dit te doen, verdunnen 0.02% tricaïne in laagsmeltende agarose tot een uiteindelijke concentratie van 0,0014%. Zodra de embryo's het juiste ontwikkelingsstadium, dechorionate de embryo's in 1 X Danieau media met een pincet te bereiken. Wanneer dechorionating, zorg ervoor dat een transparant geel filter wordt geplaatst in het pad van de witte lichtbron (zie stap 2.3). Verwarm de 0,6% laagsmeltende agarose-oplossing tot 37 ° C. Pipetteer 1 ml van laagsmeltende agarose in de put van een LabTek chambered dekglaasje dia. Monteer 3-4 embryo's in laag smeltpunt agarose en oriënteren ze met een pincet met de cellen te gefotoactiveerd naar beneden gericht tegen de onderkant dekglaasje aan. Laat de agarose te stollen. Na het stollen, pipet 1 mL van een X Danieau media over de agarose. Herhaal de stappen 2,8 tot 2,9 voor meer embryo's. 3. Twee-foton activering van gekooide fluoresceïne-dextran * Deze procedure wordt ervan uitgegaan dat het embryo verslaggever GFP uitdrukt. Het embryo wordt bekeken met behulp van de argon-ion (488 nm) laser bron verbonden aan de LSM 510 META NLO microscoop. Een enkele GFP positieve cel wordt geselecteerd en gefotoactiveerd het gebruik van de Mai Tai laser (femtoseconde laser) gekoppeld aan de LSM 510. De procedure is hetzelfde voor niet-fluorescerende embryo's. Als alternatief kan wit licht worden gebruikt om de cel te worden geactiveerd, gevolgd door activering van het gebruik van de Mai Tai laser bron te vinden. Laad de LSM 510 software. Plaats een transparant geel filter in het witte licht stralengang. Selecteer Scannen Nieuwe afbeelding en klik op Start Expert-modus. Selecteer het tabblad Laser. Zet de argon-ion (488 nm) en Mai Tai (femtoseconde) laser bronnen. Stel de Mai Tai golflengte tot 740 nm. Selecteer het tabblad config. Stel het optische pad configuratie voor de argon-ion-en Mai Tai laser. Selecteer het tabblad Scannen. Wijzig de doelstelling om 20X/0.8. Stel de maximale scansnelheid door te klikken op Max. Set Mode, Method, en nummer Line, Mean, en 1. Onder het tabblad Channels deselecteer alle laser-bronnen, behalve voor de Mai Tai. Plaats een power meter in de optische stralengang. Selecteer de Cont-knop om continu scannen te activeren. Pas de transmissie% tot de macht meter leest een gemiddeld laservermogen van 47 mW. Stop de scan door het selecteren van de knop Stop. Onder het tabblad Channels schakelt u het Mai Tai laserbron en selecteer de argon-ion (488 nm). Selecteer de Fast xy-knop. Onder het tabblad Kanalen aanpassen van de pinhole, detector te krijgen, versterker offset, en de versterker te krijgen voor de argon-ion-laser om de beste beeldkwaliteit te bereiken. Met behulp van de stage controller, te vinden en zich richten op de cel te activeren. Klik op de knop Stop. Met behulp van de zoom-tool, zoom in op de geactiveerde cel tot aan de zoom-factor onder de Mode tabblad 50 naar 70. Stop de scan door het selecteren van de knop Stop. Onder het tabblad Channels schakelt u het argon-ion-laser (488 nm) en selecteer de Mai Tai laser. Onder het tabblad Modus stel de scansnelheid tot 31.46 sec. Selecteer de Single-knop om het scannen op twee-foton activering van gekooide fluoresceïne-dextran van de geselecteerde cel te starten. Na activering, schakelt u de Mai Tai laser onder het tabblad Channels, en opnieuw de argon-ion-laser (488 nm). Stel de zoomfactor in Mode 1 en klik op de Max-knop onder de Speed ​​op weg naar de snelste scansnelheid in te stellen. Selecteer Snel xy om de gefotoactiveerd regio herzien. Controleer of de gefotoactiveerd regio niet is laser geablateerd. Voor meer informatie over laser ablatie, verwijzen wij u naar de discussie sectie. Herhaal de bovenstaande stappen voor de andere embryo's. 4. Immunodetectie van Uncaged fluoresceïne-dextran (overgenomen van Ref. 16) Na photoativation, een transparant geel filter voor het witte lichtbron en handmatig te verwijderen uit elk embryo laagsmeltende agarosegel met behulp van scherpe tang. Plaats alle verwijderde embryo's in een nieuwe petrischaaltje met verse 1 X Danieau media. Dek de petrischaal met metaalfolie om de blootstelling van embryo's aan het licht te voorkomen. Indien nodig, achter de embryo's om de gewenste ontwikkelingsstadium. In de tussentijd bereiden een 4% paraformaldehyde oplossing (zie bereiding van oplossingen). Aliquot 1,5 ml van de bereide paraformaldehyde in een microcentrifugebuis. Nadat de embryo's hebben bereikt het ontwikkelingsstadium van belang, pipet de embryo's in de microcentrifugebuis (vanaf stap 4.2). Bedek de buis met metalen folie om de blootstelling aan licht te voorkomen. 'S nachts Nutate de buis bij 4 ° C. Voor de volgende dag voor te bereiden ethanolreeks (EtOH) oplossingen in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en DDH 2 O, 30% EtOH: PBS, 50% EtOH: PBS, 70% EtOH: DDH 2 O, en 100% EtOH. De volgende dag, verwijdert u de embryo's van 4 ° C. Verwijder de metalen folie voor de buis en snel aspireren uit paraformaldehye (achter een klein volume dat is genoeg om de embryo's te dekken). Pipetteer 1,5 ml 30% EtOH: PBS in de buis. Re-cover van de buis met metaalfolie. Nutate de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Herhaal stap 4.5 met 50, 70, en 100% gesorteerd EtOH oplossingen. Na de 100% EtOH wassen, weer spoelen de embryo's in 100% EtOH voor 10 minuten. Na het wassen, 's nachts op te slaan van de embryo's bij -20 ° C. Voor de volgende dag voor te bereiden fosfaatgebufferde tussen (PBT, zie Voorbereiding van de Solutions), 5 X blokkerende buffer (zie fabrikant protocol voor voorbereiding), maleïnezuur (protocol voor de voorbereiding kan worden gevonden in het blokkeren van buffer-protocol), 10 mg / ml proteinase K, en een 10 X antilichaam-oplossing (Anti-fluoresceïne-AP, zie bereiding van oplossingen). Ook voorbereiden 2% lam serum (LS, zie bereiding van oplossingen) verdund in PBT. Bewaar het antilichaam bij 4 ° C gedurende de nacht schudden op een nutator. De 2% LS kan worden bewaard bij 4 ° C. De volgende dag te verwijderen van de embryo's van -20 ° C. Verwijder de metalen folie voor de buis en snel aspireer uit 100% EtOH. Voeg 1,5 ml 70% EtOH: DDH 2 O aan de buis. Re-cover van de buis met metaalfolie. Nutate de buis bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Herhaal stap 4.8 met behulp van 50 en 30% gesorteerd EtOH-oplossingen, en 100% PBT. Na de 100% PBT te wassen, drie keer spoelen de embryo's in 100% PBT voor 10 minuten. Als de embryo's ouder zijn dan 24 uur, proteinase K behandelen. Zo niet, ga dan naar stap 4.13. Om dit te doen, verdunnen de voorbereide proteinase K (stap 4.7) 1:1000 in PBT. Incubeer de embryo's in proteinase K voor 10 minuten, of langer indien de embryo's ouder zijn. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Na de proteinase K behandeling, was de embryo's vijf keer in PBT voor 10 minuten. Na het wassen, herstellen de embryo's in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een nutator. Daarna onmiddellijk wassen de embryo's vijf keer in PBT voor 10 minuten. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Maak blokkerende buffer door verdunning van 5 X blokkerende buffer in maleïnezuur buffer om een ​​X. de embryo's Verwijderen uit PBT en leg ze in 1 X blokkeert buffer. Bedek de embryo's met metaalfolie en nutate bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 6 uur. Na 5 tot 6 uur blokkeren, heat shock de embryo's bij 65 ° C gedurende 15 tot 20 minuten. Verkrijgen van het antilichaam oplossing en de 2% LS bereid de vorige dag. Centrifugeer het antilichaam oplossing op max toeren per minuut. Breng de waterige fase naar de 2% LS buis. Keer de buis om te mengen. Overdracht van de embryo's uit het blokkeren van buffer naar de LS-antilichaam mengsel. Houd de embryo's bedekt met metaalfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Nutate de embryo's bij 4 ° C gedurende de nacht. De volgende dag was de embryo's bij kamertemperatuur zes keer voor 15 minuten in PBT. Bereid AP buffer (zie bereiding van oplossingen). Was de embryo's bij kamertemperatuur 2 keer voor 10 minuten in de AP-buffer. Bereid NBT / BCIP het ontwikkelen van oplossing (zie bereiding van oplossingen). Overdracht van de embryo's te NBT / BCIP. Laat de vlek te ontwikkelen in het donker. Stoppen met de ontwikkeling door het wassen van de embryo's drie keer in PBT voor 5 minuten per stuk. Voor het imago van acquisitie Monteer de embryo's in 0,6% laag smeltpunt agarose of 3% methylcellulose, en het verwerven van beelden met behulp van een omgekeerde of rechtop samengestelde microscoop. Gefotoactiveerd monsters kunnen worden opgeslagen voor toekomstige analyse (vlekken blijft stabiel) door het dehydrateren van hen in een gegradeerde EtOH wassen. Volg de stappen 4.4 tot en met 4.7 voor het drogen van de monsters. 5. Representatieve resultaten: Figuur 1. Fotoactivatie van gekooide fluoresceïne-dextran. (A, B) helderveld en fluorescentie beeld van een zijaanzicht zebravis embryo in het stadium vóór 13/14-somite fotoactivatie. (C, D) De embryo werd gefotoactiveerd in the13/14-somite stadium in een van de somieten (pijl) met een golflengte van 740 nm, scantijd van 31 seconden, en een gemiddelde laservermogen van 47 mW. Post-activering, (d) fluorescentie van Uncaged fluoresceïne-dextran wordt waargenomen. Oriëntatie: Dorsale (rechts), buik (links). Schaalbalk 100 micrometer. Figuur 2. Immunodetectie van gekooide fluoresceïne-dextran. Figuur 2 geeft de immunokleuring van Uncaged fluoresceïne-dextran in een 18/19 hpf zebravis embryo. Bij de 10-somiet stadium een ​​klein gebied van het embryo werd geactiveerd in de laterale plaat mesoderm met behulp van dezelfde laser parameters vermeld in figuur 1. Met behulp van de immunodetectie procedure, de pijl geeft de geactiveerde regio met een minimale achtergrondkleuring. Oriëntatie: Dorsale (boven), Ventraal (onder). Schaalbalk 100 micrometer.