واحدة رسم الخرائط ذات الصلة مصير الخليوي في الزرد
Summary
ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.
Abstract
القدرة لتسمية تفاضلي الخلايا واحدة لديه آثار هامة في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال، تحديد كيفية المكونة للدم، الأنساب سفينة اللمفاوي، والدم تنشأ في النامية الأجنة يتطلب رسم الخرائط مصير وسلالته البحث عن المفقودين من الخلايا السلائف غير متمايزة. في الآونة الأخيرة، والبروتينات photoactivatable والتي تشمل: لقد تلقت إيوس 1، 2، PAmCherry 3، Kaede الذي 4-7، pKindling 8، وKikGR 9 و 10 الفائدة واسعة كما تحقيقات الخلية البحث عن المفقودين. يمكن أن تتحقق الطيف مضان من هذه البروتينات للضوء تحويلها بسهولة مع الإثارة UV، مما يسمح للإلى يمكن تمييزها يبلغ عدد سكانها من الخلايا من تلك التي المتاخمة لها. ومع ذلك، يجوز للphotoefficiency من البروتين المفعلين يمكنهم تحد من طويلة الأجل الخلية تتبع 11. كبديل للالبروتينات photoactivatable، في قفص وقد تم فلوريسئين-ديكستران المستخدمة على نطاق واسع في نظم نموذجية لالجنين 7، 12-14. تقليديا، إلى uncage فلوريسئين-ديكستران، UV كسكيتوقد استخدم أوجه من منزل مصباح مضان أو أ UV الفوتون ليزر واحدة؛ ومع ذلك، مصادر مثل هذه تحد من القرار المكاني للتنشيط ضوئي. هنا ونحن يقدم تقريرا على بروتوكول إلى خريطة مصير، التتبع سلالته، وكشف عن واحدة الخلايا المسمى. يتم photoactivated الخلايا واحد في الأجنة حقن مع في قفص فلوريسئين-ديكستران مع البقول ليزر بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء المنتجة من أ الفيمتو ثانية التيتانيوم ليزر الياقوت. هذا الليزر هو العرفي في جميع المجاهر اثنين من الفوتون مبائر مثل المجهر 510 LSM NLO META المستخدمة في هذا الورق. منذ الأنسجة البيولوجية يكون شفافا بالنسبة بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء التشعيع 15 يمكن أن، أن يركز عليها البقول ليزر عميقة داخل الجنين دون uncaging الخلايا أعلاه، أو أدناه الطائرة التنسيق المحددة. ولذلك، يتم التي يسببها غير الخطية اثنين من الفوتون امتصاص فقط عند بؤرة هندسية إلى uncage فلوريسئين-ديكستران في خلية واحدة. للكشف عن والخلية التي تحتوي uncaged فلوريسئين-ديكستران، ونحن تصف على بروتوكول الكيمياء الهيستولوجية المناعية بسيطة 16 إلى visua بسرعةليز الخلية المنشط. للبروتوكول التنشيط وكشف عن المعروضة في هذا الورقة هو متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على أي نظام نموذج.
ملاحظة ما يلي: ويمكن الاطلاع على الكواشف المستخدمة في هذا بروتوكول في بموجب الجدول المرافق في نهاية من هذه المادة.
Protocol
Discussion
وتصف هذه الورقة طريقة تنوعا لواحدة خلية تعيين مصير استنادا إلى تنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران. Uncaging من قفص فلوريسئين-ديكستران في الخلايا واحدة ويتحقق باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من الفيمتو ثانية ماي الليزر تاي بالإضافة إلى المجهر LSM زايس META 510 مبائر. Uncaged فلوريسئين-ديكستران في الخلايا photoactivated هو تصور بسرعة باستخدام إجراء المناعية بسيطة.
في هذا البروتوكول الطول الموجي امتصاص ثنائي الفوتون لتنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران هو 740 نانومتر. تم تحديد تجريبيا هذا الطول الموجي من photoactivating قفص فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype حقن. وقد تباينت الطول الموجي الإثارة الليزر 600 حتي 800 نانومتر، وكان مصمما نوعيا وجود أو عدم وجود مضان فلوريسئين تفعيل بعد. وجدنا أن 740 نانومتر ينتج إشارة فلوريسئين تفعيل أقوى التالية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن 740 نانومتر العمل للجميعنظم نموذجية، ومع ذلك، فإننا ننصح اختبار مجموعة من موجات لتحديد الأمثل الطول الموجي الإثارة ثنائي الفوتون لعينتك.
في قفص حقن فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype، لكل طول موجي الإثارة ثنائي الفوتون نحن اختبار تفاوتت أيضا قوة الليزر المتوسط. لطول موجة الإثارة من 740 نانومتر، وهي قوة الليزر المتوسط من 47 تنتج ميغاواط إشارة أقوى فلوريسئين في المنطقة المنشط بالمقارنة مع خفض القوى الليزر المتوسط. لم العالي القوى الليزر العادي لا ينتج إشارات أقوى فلوريسئين، ولكن الاجتثاث الناجم عن الأنسجة. منذ نبضات الليزر الفيمتو ثانية هي فعالة في الأنسجة البيولوجية ablating 15، نوصي تحديد الليزر متوسط طاقة عتبة تنشيط ضوئي أن يتجنب الاجتثاث الأنسجة.
ثنائي الفوتون امتصاص يحدث خلال حجم التفاعل الصغيرة. لضمان تفعيل السليم للقفص فلوريسئين-ديكستران، يجب أن توضع الخلية في الخشوع. في اله فوق البروتوكول، وتصويرها في وقت واحد الخلايا GFP إيجابية تحت الضوء الأبيض لتأكيد التركيز الخلية. لذلك، بيضاء اكتساب ضوء بالإضافة إلى قنوات أخرى من المستحسن. بعد التأكد من تركيز الخلية، بروتوكول لدينا تشير إلى تعظيم خلية المنشط. ويقترح وهناك عامل التكبير من 50 إلى 70، ولكن هذه القيمة يعتمد على حجم الخلية المختارة. زيادة التكبير يعزل الخلية المنشط من الخلايا المجاورة، ويحد منطقة المسح الضوئي لمدة الفوتون التنشيط. من الناحية المثالية، ينبغي أن منطقة المسح الضوئي تغطي مساحة واسعة من الخلية.
الكشف عن واحدة الخلايا تفعيلها يتطلب أن تلطيخ الخلفية يكون ضئيلا للغاية. في بروتوكول مناعي أعلاه فإنه من المهم أن يتم حظر العينة في حجب العازلة لمدة 5 إلى 6 ساعات (الخطوة 4.13). عند وضع مع NBT / BCIP، ينبغي uncaged فلوريسئين-ديكستران تصبح مرئية خلال 10 إلى 20 دقيقة. إذا تلطيخ خلفية قوية، نقترح يغسل يعد حظر الوقت وإضافية لإزالة مكافحةالجسم (الخطوة 4.17).
الأرقام 1 و 2 تقديم نتائج ممثل تنشيط ضوئي ومناعي. في الشكل 1، 1 في وقت مبكر – تم حقن ل2-الخلية الأجنة wildtype المسرح مع قفص فلوريسئين-ديكستران. وأثيرت الأجنة لsomitogenesis المتوسطة والتي تقام في الاغاروز انصهار منخفضة في الاتجاه الجانبي. الشكل 1 (أ، ب) تصور brightfield والصور الفلورسنت من الجنين قبل تنشيط ضوئي. ويتجلى دليل على أن الجنين لا يزال uncaged بسبب عدم وجود مضان فلوريسئين في الشكل 1 (ب). تم تفعيل منطقة صغيرة داخل الجسيدة مع طول موجة من 740 نانومتر لمدة 31 ثانية باستخدام قوة الليزر المتوسط من 47 ميغاواط، الشكل 1 (ج؛ السهم). حدث بعد تفعيل، واثنين من الفوتون uncaging من فلوريسئين-ديكستران كما يتضح من مضان من منطقة تفعيلها، الشكل 1 (د؛ السهم). لم تكن مصحوبة التنشيط من خلال التذرية الليزر، حيث أن الأنسجة somitic ظلت على حالها، الشكل 1 (ج). الشكل 2 يوضح مناعي من فلور uncaged escein-ديكستران. وphotoactivated منطقة صغيرة في الأديم المتوسط وحة الجانبية للجنين المرحلة 10-الجسيدة باستخدام المعلمات ليزر نفس المذكورة في الشكل 1. تم رفع الجنين ومعالجتها باستخدام الخطوات 4،1 من خلال 4،20. السهم في يقع 2 الشكل المنطقة تفعيلها، كما يدل على ذلك تراكم راسب أزرق. تم الكشف بوضوح فقط موقع المنشط دون التدخل تلطيخ الخلفية.
إعداد الحلول:
1 X PBT (1 L)
100 مل 10 X PBS
2 غرام BSA
10 مل توين 20٪
10 X PBS (1 L)
80 جم كلوريد الصوديوم
2 غرام بوكل
6،1 ز نا 2 HPO 4
1،9 ز KH 2 PO 4
DDH 2 O إلى 1 L
الرقم الهيدروجيني إلى 7.3
4٪ لامتصاص العرق (160 مل)
32٪ لامتصاص العرق (كل منهما 10 قارورة مل)
8 مل 20 X PBS
132 مل DDH 2 O
1 مل 5 M كلوريد الصوديوم
2.5 مل 1 M MgCl 2
5 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9،5
250 ميكرولتر توين 20٪
41،25 مل DDH 2 O
حل الأجسام المضادة (لمدة 1 العينة)
5،5 مسحوق الأسيتون ميكرولتر
40 PBT ميكرولتر
0،8 LS ميكرولتر
0.1 ميكروليتر مكافحة فلوريسئين-AP الأجسام المضادة
2٪ LS (360 ميكرولتر لمدة 1 العينة)
7،2 ميكرولتر LS 100٪
352،8 PBT ميكرولتر
1 X Danieau وسائل الإعلام (1 L) ‡
11،6 5 مل M كلوريد الصوديوم
700 ميكرولتر 1 M بوكل
400 ميكرولتر 1 M MgSO 4
600 ميكرولتر 1 M كا (NO 3) 2
5 مل 1 HEPES M
DDH 2 O إلى 1 L
درجة الحموضة ضبط إلى 7.6
‡ Danieau هو الحل الملح مثالية لتربية الأجنة الزرد dechorionated. شريطة أن يمكن استخدام وسائل الإعلام الأخرى، والحلول متساوي التوتر مع بروperly الأسمولية (~ 300 الميلي أسمول لالزرد)
NBT الأسهم (1 مل)
50 ملغ نيترو الأزرق تترازوليوم
0،7 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل
0.3 مل DDH 2 O
BCIP الأسهم (1 مل)
50 ملغ 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl الفوسفات
1 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل
NBT / BCIP حل النامية
1 مل AP العازلة
4،5 الأسهم NBT ميكرولتر
3،5 الأسهم BCIP ميكرولتر
الأسيتون مسحوق
- حدد 20 سمكة الكبار وتجميدها في النيتروجين السائل.
- طحن الأسماك المجمدة مع بمدافع الهاون والمدقه إلى مسحوق.
- نقل مسحوق الأسماك في أنبوب 50 مل المخروطية.
- ملء الأنبوب المخروطية مع الأسيتون 100٪. دوامة الأنبوب.
- تدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
- غسل بيليه آخر 3 مرات في الأسيتون 100٪ وتدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. Bيجب Y غسل مشاركة طاف تظهر واضحة.
- إضافة 100 الأسيتون٪ إلى بيليه مرة أخرى، والسماح للأنبوب تصل إلى درجة حرارة الغرفة. فإن جزيئات أكثر كثافة تسوية، في حين أن الجسيمات الدقيقة ستبقى في التعليق.
- صب على الجسيمات الدقيقة في أنبوب جديد. قسامة الحل مسحوق في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر J. تشن لتوفير قفص بروتوكول التوليف فلوريسئين-ديكستران. وأيد هذا البحث من قبل شهر مارس من جائزة الدايمات 5 FY09-78، أمريكا جائزة جمعية القلب 09BGIA2090075، وجائزة NIH / NHLBI R01 HL107369-01 لSS A الخاصة. شكرا لClosson C. للمساعدة المجهري له
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce | 89889 |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A |
| Anti-fluorescein-AP | Roche | 11376622 |
| Blocking buffer | Roche Applied Sciences | 11 096 176 001 |
| Maleic Acid | Sigma | MO375-500G |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 |
| NBT | Sigma | I8377-250mg |
| BCIP | Fischer Scientific | PI-34040 |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc International | 155380 |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 |
| LSM 510 META NLO | Zeiss | |
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Zeiss | |
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
Referencias
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 .
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. . Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
