DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bisülfit dönüşüm protokolü Genomik DNA 2 mikrogram dönüşüm için standart bir protokol aşağıda açıklanmıştır. Genomik DNA (100 pg-200 mg) daha küçük veya büyük miktarda, aynı zamanda başarılı bir şekilde tedavi bisülfit olabilir. Bu tepkime koşulları hemen hemen her hedef DNA dizisi 3 tam dönüşüm (% 99,5-99,7) sonuçlanır. 1. DNA hazırlığı 37 ° C Not 1 saat için 18 ul toplam hacim bisülfit DNA Lizis Buffer (2 mg t RNA 280 ng / ul Proteinaz K,% 1 SDS) ile genomik DNA kuluçka örnekleri hazırlayın: Bunu başarmak için önemlidir. özellikle hala DNA ile ilişkili protein olabilir klinik örneklerden izole edilen DNA ile maksimal bisülfit dönüşüm . 2. DNA denatürasyonu Son c taze hazırlanmış 3M NaOH 2 ul ekleyerek 20 ul bir ses doğasını 2 mg DNA0.3M, oncentration. 37 ° örnekleri inkübe ° C su banyosunda 15 dakika süreyle bir ısı bloğu içinde 2 dakika süreyle 90 ° C'de inkübasyon izledi. Hemen 5 dakika boyunca buz üzerinde tüplerin yerleştirin. 4 ° C, 10 s 10.000 g sağlamak için DNA tüpün dibinde tüplerin santrifüjleyin. 3. Bisülfit Deaminasyon Sülfonasyon & Hidrolitik Deaminasyon 10 mM Quinol ve doymuş sodyum metabisülfit pH 5.0 (464 ul 10 M NaOH ile 7.6 g Na 2 S 2 O 5, 15 ml su ile yapılmış) taze çözümler hazırlayın. Doymuş sodyum bisülfit çözüm asgari karıştırma ve havalandırma ile, yavaşça tersine reaktif / H 2 O karışımı ile elde edilir. Gerekirse, metabisülfit Not tam olarak kapatılması için 10 M NaOH ile pH ayarı: doymuş bir çözüm olduğu için, küçük topaklar hala çözünmeden kalır . 208 ekle2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5.0 nihai konsantrasyonu 240 ul nihai hacmi doymuş metabisülfit ve denatüre DNA (20 ul) 10mM Quinol 12 ul ul. Damlacıkları tüpün alt kısmında sağlamak için 10 sn için tüm reaktifler ve santrifüj yavaşça karıştırın. 200 ul madeni yağ numuneleri Overlay. Numuneler 55 ° C su banyosu, 4-16 saat inkübe edin. Bisülfit tedavi süresini dönüştürülecek DNA miktarı ve kalitesi bağlıdır. Kalitesiz ya da bozulmuş DNA DNA, 4 saat inkübasyon süresi sınırı Not: inkübasyondan önce folyo tüpler mümkün şal değildir eğer öyleyse, bu bisülfit dönüşüm oksidasyon önlemek için karanlık yer aldığı önemlidir. . Uygun inkübasyon süresi sonunda, tüm sıvı tüpün dibinde olduğundan emin olmak için bir mikrosantrifüj kısaca tüpler döndürmek. Bisülfit tedavi DNA Kurtardikkatle herhangi bir mineral yağ almadan, tüpün dibinden DNA çözüm pipetleme yağ tabakasının altında. Tuzsuzlaştırma Tuzsuzlaştırma sütun geçerek, 50 mili-Q suyu (MQH 2 O) ul salınımlı herhangi bir ücretsiz bisülfit iyonlarının çıkarın . Genomik DNA'nın miktarı ve kalitesi üzerinde ve nasıl hazırlanır bağlı olarak, farklı tuzsuzlaştırma sütun kullanılabilir. Biz rutin olarak bu sütunların SDS dönüşüm için önce DNA hazırlanmasında kullanılan kaldırmak için uygun Promega Sihirbazı, sütunlar temizleyin kullanın. Alkali Desulphonation Bisülfit adduct desulphonation urasil halka çıkarılır. Desulphonate 0.3M bir son konsantrasyonu 5.5 ul taze hazırlanmış 3M NaOH ekleyerek, örnekleri daha sonra 37 ° C'de 15 dakika süreyle kuluçkaya yatmaktadır. Kısaca Santrifüj ve t RNA (10 mg / ml) 1 ul ekleyin. <li> amonyum asetat 33 ul (NH 4 O Ac), 3M nihai konsantrasyonu pH 7.0 ilavesi ile çözüm nötralize. Buz gibi% 100 etanol 330 ul ekleyerek Etanol çökelti DNA tersine çevirerek iyice karıştırın. -20μC gecede 1 saat bırakın. 15 dakika 14.000 g Santrifüj 4 ° C Süpernatant ve hava tüm izlerini ~ 20 min çöktürülmüş DNA kuru çıkarın. 0.1 TE (10mM Tris-HCL, 0.1mm EDTA, pH 8.0) veya H 2 O 50 ul / mg DNA pelet yeniden askıya Yaklaşık 2 saat oda sıcaklığında bekletin. DNA sağlamak Bazen vorteks tüpleri, ardından hızlı bir santrifüj, çözünmüş. DNA miktar ve kalitesine bağlı olarak 1-10 yıl boyunca -20 ° C'de PCR veya mağaza için hemen kullanın. 4. PCR Amplifikasyon Primer Tasarım PCR bisülfit dönüşüm spesifik primerler Etkin tasarım crucial DNA'nın tamamen dönüştürülen bu verimli, tarafsız amplifikasyon sağlamak için oluşur. Aşağıdaki yönergeler, astar tasarım yardım için kullanılacak. Primer Tasarım Kuralları Thermocyling Orantılı metillenmiş ve unmethylated DNA PCR testi için, bir metil 50:50 / Unmethylated tam bisülfit dönüştürülür kontrol örneği kullanın ve optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları (Şekil 3) altında bisülfit dönüşüm spesifik primerler ile amplifiye. 50:50 metil: Unmethylated kontrolü, in vitro SssI metillenmiş DNA ve ya tüm genom (WGA) amplifiye DNA veya tam kan DNA kullanın. Bazı genlerin doğal kan metil ve bu nedenle bu gibi durumlarda sadece "Unmethylated" kontrol WGA DNA kullanmak en iyisi olacaktır ki farkında olun. 100 & m PCR reaksiyon karışımları hazırlayınu; l 2 ul dönüştürülür bisülfit genomik DNA, 200 mcM dNTP, 1 mcM primerler, 1.5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10mM Tris-HCL, pH 8.3 ve 0.15 ul Taq polimeraz içeren alikotları. 3 ° C üzerinden astar tahmin Tm 10 tüp, bir sıcaklık degrade PCR degrade çalıştırmak reaksiyon + / Metillenmiş ve unmethylated amplikonlarının orantılı olarak amplifiye olduğunu test etmek için, Amplikon metillenmiş DNA sindirimi Taq 1 (TCGA) gibi bilgilendirici bir restriksiyon enzimi, sindirilmiş, ancak kısıtlama enzim sitesi unmethylated DNA sindirimi olmaz TTGA için bisülfit dönüşüm sonra değiştirdi. Sindirim ölçüde agaroz jel elektroforezi (Şekil 3A) tarafından görüntülenmiştir. Alternatif olarak, PCR reaksiyonu SYBRGreen (0.2 1:1000 dilüsyon ul) eklenir ve olabilirmetilasyon ölçüde bir real-time PCR PCR (Şekil 3B) ısı disosiasyon araziler yaparak değerlendirilebilir. MgCl 2 konsantrasyonu ve thermocycling koşulları da dahil olmak üzere PCR Reaksiyon karışımı PCR verimliliğini artırmak veya metil ve unmethylated PCR parçaları orantılı PCR sağlamak için ayarlanması gerekebilir. PCR koşulları optimize sonra, PCR bisülfit dönüştürülen numuneler üzerinde yapılacaktır Not: Bir kez Tm sıcaklık degrade PCR kullanılabilir gerekmez optimize edilmiştir . 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bisülfit PCR optimizasyonu bir örnek Şekil 3'te gösterilmiştir. Optimal PCR amplifikasyon koşulları oran ve önyargısız, metil ve unmethylated amplikonlarının yükseltilmesi gerekir. Şekil 3A% 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili ile bir agaroz jel gösterir. The PCR amplikonlarının metillenmiş sindirimi bir kısıtlama enzim, Taq 1 (TCGA), (M) DNA ile tedavi edilmiştir ancak TTGA için bisülfit dönüşüm restriksiyon enzimi sitesi tarafından değiştirilmiş olarak (U) DNA unmethylated sindiremez. Kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü eşit miktarda metil ve unmethylated DNA orantılı olarak yükseltilir bekleniyor. -Önyargı olmayan amplifikasyonu için optimal thermocyling koşulları 56.1 olduğunu, bu jel üzerinde görülebileceği ° C (T). Bisülfit DNA komple dönüşüm sitozin-sitesi hpa III (CCGG) gibi spesifik bir enzim ile sindirime de analiz edilebilir. Dönüştürme başarısız oldu hpa III sadece kısıtlama sitesi muhafaza edilecektir sindirir. Dönüştürme işlemi tamamlandığında ise kısıtlama site TCGG veya DNA metilasyon durumu bağlı TTGG dönüştürülmüş olacak. Komple bisülfit DNA dönüşüm Şekil 3A (H) görülebilir. Şekil 3B gerçek zamanlı bir ayrılma arsa gösterirfarklı moleküller ayrıştırmaları hangi sıcaklık dayalı herhangi bir amplifikasyon önyargı var olup olmadığını belirlemek için bir araç olarak da kullanılabilir. Bu şekilde PCR 82.1μC az ayrıştırmaları tamamen metillenmiş ve unmethylated DNA amplifikasyon kontrol ile karşılaştırıldığında,% 50 metillenmiş ve unmethylated DNA karışımı oranında metil amplifiye (M) ve (U) unmethylated DNA olduğunu görülebileceği sırasıyla 78.9μC. Thermocyling ve reaksiyon koşullarının optimizasyonu sonra bisülfit tedavi örnekleri tek bir ya da yarı nested PCR reaksiyon ya iplikçik bisülfit özel ve spesifik primerler ile amplifiye edilebilir. Çıkan PCR parçaları agaroz jel elektroforezi ile görüntülenir (Şekil 4A) ya doğrudan ya da klonlama ve sıralama sıralı olabilir. Klonlama ve bireysel moleküllerinin metilasyon devlet sıralama heterojen görselleştirmek için bisülfit bir harita (Şekil 4B), cetvel sonrametilasyon. Yüksek verim kantitatif metilasyon analizi gibi Sequenom EpiTYPER yöntemi tarafından kullanılan teknoloji kullanılarak preformed olabilir. Bu yöntemi kullanarak, bisülfit dönüştürülür DNA bisülfit spesifik PCR primerleri ile amplifiye ve bir proprietry bölünme süreci izledi. Çıkan parçaları metil cytosines (Şekil 5A) varlığına bağlı özel spektrum MALDI-TOF kütle spektrometresi tarafından quantitated. Metilasyon oranları örnek bir özetini sonra bir özdeyişinin (Şekil 5B) veya metilasyon arsa (Şekil 5C) şeklinde çıkarım olabilir. Şekil 1. (Gri) gen bedenlerinizde CpG siteleri seyrek ve genellikle metil (kırmızı) ise normal hücre, organizatörü ile ilişkili CpG adalar ağırlıklı metil CpG şematik. Unmethylated. Sağdaki panel, moleküler yapısı genişletirbireysel bir CpG yerinde DNA ure ve sitozin 5 karbon CH3 molekülü ile metilasyon gösterir. Şekil 2. Denatürasyon, bisülfit dönüşüm, PCR ve analizi; Kimyasal dönüşüm şematik analizi, DNA metilasyon gösterildiği gibi dört ana aşama içerir . Sağ panelde, sitozin molekülünün bisülfit dönüşüm sırasında meydana gelen değişiklikler tasvir edilmektedir. Şekil 3. PCR A. Optimizasyonu % 50 metil ve unmethylated DNA karışımı bir sıcaklık gradyanı PCR profili agaroz jel elektroforez. Fragments sırasıyla metillenmiş DNA ve olmayan bisülfit dönüştürülür DNA sindirimi Taq1 (T) veya HpaIII (H) ya da sindirilmiş edilmiştir. B. Isı dissosiyasyon eğrisi analizi denklemleri gösterirmetillenmiş ve unmethylated DNA (kırmızı çizgi 50/50 mix) l oranı kontrolü tamamen metillenmiş amplifikasyon (pembe çizgi, M) ve ° C ve 78.9 ° C sırasıyla 82.1 ayrıştırmaları unmethylated DNA (yeşil hat, U). Şekil 4. Doğrudan sıralama örneği ve bisülfit haritası A. Sıra iz sarı vurgulanır CpG siteleri ile üç farklı hücre hatları. Hücre hattı X hücre hatları Y ve Z G / A sinyaller üst üste görüldüğü gibi metilasyon değişik derecelerde ise her üç CpG siteleri% 100 metilasyon gösterir. B., bireysel klonların doğrudan sıralama belirlenir, bireysel CpG siteleri metilasyon (kırmızı noktalar) yoğunluğu gösteren Temsilcisi bisülfit harita. <br /> Şekil 5. Sequenom A. kullanarak yüksek verim DNA metilasyon analizi Sequenom epiTYPER teknolojisini kullanarak Spektrum görünümü. DNA parçalarının DNA metilasyon mevcut miktarına bağlı olarak, belirli spektrumları gösterir. B. DNA metilasyon yüzde CpG dört farklı hücre hatları için her yerinde özdeyişinin özeti. C. Metilasyon arsa özeti Sequenom özdeyişinin türetilmiştir.