La metilación del ADN: Bisulfito de modificación y análisis

Bisulfito de conversión de protocolo Un protocolo estándar para la conversión de 2 mg de ADN genómico se describe a continuación. Cantidades más pequeñas o más grandes de ADN genómico (100 pg-200 mg) puede también ser tratado con éxito de bisulfito. Estas condiciones de reacción como resultado una conversión completa (99,5 a 99,7%) de casi todas las secuencias de ADN objetivo del 3. 1. Preparación de ADN Preparación de muestras mediante la incubación de ADN genómico con bisulfito de buffer de lisis de ADN (2 ug de ARN t, 280 ng / l de proteinasa K, 1% SDS) en un volumen total de 18 l durante 1 hora a 37 ° C. Nota: Esto es importante para lograr conversión de bisulfito de máxima, especialmente con el ADN aislado de muestras clínicas, donde todavía puede haber proteína asociada con el ADN. 2. Desnaturalización del ADN Desnaturalizar 2 mg de ADN en un volumen de 20 l mediante la adición de 2 l de recién preparada 3M NaOH a una final de concentration de 0,3. Incubar las muestras a 37 ° C durante 15 minutos en un baño de agua, seguido de incubación a 90 ° C durante 2 minutos en un bloque de calor. Inmediatamente se colocan los tubos en hielo durante 5 min. Centrifugar los tubos a 4 º C durante 10 s de 10.000 g, para asegurar que el ADN se encuentra en la parte inferior del tubo. 3. La desaminación de bisulfito Sulfonación y desaminación hidrolítica Prepare nuevas soluciones de 10 mM de sodio y grasas saturadas Quinol pH 5,0 metabisulfito (7,6 g de Na 2 S 2 O 5, con 464 l de 10 M NaOH, de hasta 15 ml con agua). La solución de bisulfito de sodio saturado se logra invirtiendo suavemente el reactivo / H 2 O mezcla, con la mezcla mínima y la aireación. Si es necesario, ajustar el pH con NaOH 10 M, para la disolución completa de la Nota de metabisulfito:. Como se trata de una solución saturada, pequeños bultos todavía no se han disuelto. Añadir 208l de la metabisulfito saturada y 12 l de 10 mM Quinol al ADN desnaturalizado (20 l), en un volumen final de 240 l con una concentración final de 2.31M bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Mezclar suavemente todos los reactivos y centrifugar durante 10 segundos para asegurar todas las gotitas están en el fondo del tubo. Superposición de las muestras con 200 l de aceite mineral. Incubar las muestras a 55 ° C en un baño de agua, de 4.16 hrs. La duración del tratamiento bisulfito depende de la cantidad y la calidad del ADN que se va a convertir. Para el ADN de mala calidad o ADN degradado, limitar el tiempo de incubación de 4 horas. Nota: es importante que los que la conversión de bisulfito se lleva a cabo en la oscuridad para evitar la oxidación, por lo que si que no es posible envolver los tubos en papel de aluminio antes de la incubación . Al final del tiempo de incubación adecuado, girar los tubos brevemente en un microcentrífuga para asegurar que todo el líquido se encuentra en la parte inferior del tubo. Recuperar el ADN de bisulfito de tratadospor debajo de la capa de aceite con cuidado pipeteando la solución de ADN de la parte inferior del tubo, sin ocupar ninguno de los aceites minerales. Desalación Eliminar cualquier iones bisulfito libre al pasar a través de una columna de la desalación y eluyendo en 50 l de agua milli-Q (MQH 2 O). Dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN genómico y cómo se prepara, distintas columnas de la desalación se puede utilizar. Nosotros usamos Promega Asistente para limpieza de columnas, ya que estas columnas son adecuados para eliminar el SDS utilizados en la preparación del ADN antes de la conversión. Desulphonation álcali El aducto de bisulfito se retira el anillo de uracilo por desulphonation. Desulphonate mediante la adición de 5,5 l de recién preparada 3M NaOH a una concentración final de 0,3 M, luego incubar las muestras a 37 ° C durante 15 min. Centrifugar brevemente y agregar 1 l de ARN t (10 mg / ml). <li> Neutralizar la solución con la adición de 33 l de acetato de amonio (NH 4 Ac O), pH 7,0 a una concentración final de 3M. Etanol precipitar el ADN mediante la adición de 330 l de helado 100% de etanol, mezclar bien por inversión. Dejar en-20μC durante 1 hora o toda la noche. Centrifugar a 14.000 g durante 15 min a 4 ° C. Eliminar todos los rastros de sobrenadante y secar al aire el ADN se precipitó a ~ 20 min. Vuelva a suspender el pellet de ADN en 50 l / g de 0,1 O. TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) o H 2 Dejar a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. De vez en cuando los tubos de vórtice para asegurar que el ADN se disuelve, seguido por una centrifugadora rápida. Uso inmediato para la amplificación de PCR, o almacenar a -20 ° C durante 10-10 años, dependiendo de la cantidad y la calidad del ADN. 4. Amplificación Primer diseño Diseño efectivo de PCR bisulfito de conversión de los primers específicos es crucial para asegurar que la amplificación eficiente e imparcial de ADN completamente convertido ocurre. Las siguientes pautas se utilizan para ayudar al diseño de imprimación. Directrices diseño de la cartilla Thermocyling Para la prueba de amplificación de PCR proporcional de ADN metilado y no metilado, use un metilados 50:50 / Unmethylated totalmente bisulfito de la muestra de control convierten y amplifican con el bisulfito de conversión de cebadores específicos de las condiciones de reacción optimizadas PCR (Figura 3). Para el 50:50 metilados: Unmethylated control, el uso in vitro de ADN metilado y LICE ya sea de todo el genoma amplificado (WGA) de ADN o de ADN de sangre total. Tenga en cuenta que algunos genes se metila naturalmente en la sangre y por lo tanto, en estos casos lo mejor es usar sólo WGA ADN como el "Unmethylated" de control. Prepare las mezclas de amplificación de PCR en 100 & mu; alícuotas l que contiene 2 l de bisulfito de ADN genómico convertidos, 200 mM dNTP, cebadores 1 M, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3 y 0,15 l de Taq polimerasa. En un termociclador de gradiente de temperatura, ajuste la reacción se ejecutan en un gradiente de + / – 3 ° C en la predicción de Tm de la cartilla a través de 10 tubos Para probar que los amplicones metilado y no metilado se han ampliado en proporción, la amplificación puede ser digerido con una enzima de restricción informativa, como Taq 1 (TCGA), que va a digerir ADN metilado, pero no va a digerir ADN no metilado en el sitio de la enzima de restricción es alterada después de la conversión de bisulfito de TTGA. La extensión de la digestión puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa (Figura 3). Por otra parte, SYBRGreen (0,2 l de dilución 1:1000) se puede agregar a la reacción de PCR yel grado de metilación puede ser evaluado mediante la realización de las parcelas de calor de disociación en un termociclador en tiempo real PCR (Figura 3B). Mezcla de reacción PCR incluyendo MgCl2 condiciones de concentración y termociclado posible que tenga que ser ajustada para aumentar la eficiencia de la PCR o para asegurar una amplificación proporcional PCR de los fragmentos de PCR desnaturalizado y no metilado. Una vez que las condiciones de PCR han sido optimizados, la amplificación por PCR se puede realizar en muestras de bisulfito convertidos. Nota: Una vez que la Tm se ha optimizado un gradiente de temperatura PCR no es necesario usar. 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de optimización de bisulfito de amplificación por PCR se muestra en la Figura 3. Condiciones óptimas de amplificación por PCR se amplifican amplicones metilados y no metilados en proporción y sin prejuicios. La figura 3A muestra un gel de agarosa con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. ªe amplicones de la PCR se han tratado con una enzima de restricción Taq 1 (TCGA), que se digieren metilada (M) de ADN, pero no va a digerir no metilados (U) de ADN, como el sitio de la enzima de restricción se ve alterada por la conversión de bisulfito de TTGA. Una cantidad igual de cortar y cortar producto de PCR se espera si el ADN metilado y no metilado se amplifica en proporción. Se puede ver en este gel que las condiciones óptimas para thermocyling no sesgo de amplificación es de 56,1 ° C (T). Conversión completa del ADN de bisulfito también pueden ser analizados por la digestión con la enzima citosina-sitio específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III sólo digerir si la conversión ha fallado, como el sitio de restricción se mantendrá. Si la conversión se ha completado el sitio de restricción se convierte en TCGG o TTGG dependiendo del estado de metilación del ADN. Conversión completa de ADN de bisulfito se puede ver en la figura 3A (H). Figura 3B muestra una gráfica de tiempo real que la disociaciónTambién se puede utilizar como una herramienta para determinar si existe algún sesgo de amplificación basada en la temperatura a la que las diferentes moléculas se disocian. En esta figura se puede observar que el PCR ha amplificado desnaturalizado (M) y el ADN metilado (U) en proporción de una mezcla de ADN de 50% metilado y unmethylated en comparación con la amplificación de ADN de control totalmente metilado y unmethylated que se disocian en 82.1μC y 78.9μC respectivamente. Después de la optimización de las condiciones de reacción y thermocyling bisulfito muestras tratadas pueden ser amplificados con primers específicos capítulo específico y bisulfito, ya sea en una sola reacción anidada o semi-PCR. El resultado de fragmentos de PCR puede ser visualizado por electroforesis en gel de agarosa y se secuencia, ya sea directamente (Figura 4) o por la clonación y secuenciación. Después de la clonación y la secuenciación del estado de metilación de las moléculas individuales pueden ser identificados con claridad en un mapa de bisulfito (Figura 4B), para visualizar la heterogeneidad demetilación. Análisis de alto rendimiento cuantitativo de metilación puede ser preformado uso de la tecnología, como la utilizada por el método EpiTYPER Sequenom. El uso de este método, el ADN se amplifica bisulfito convertido con bisulfito de cebadores específicos de PCR y seguido por un proceso de división proprietry. Los fragmentos resultantes se cuantifican por espectrometría de masas MALDI-TOF con el espectro específico depende de la presencia de citosinas metiladas (Figura 5). Un resumen de los ratios de metilación en la muestra puede ser extrapolado en forma de un epigrama (Figura 5) o la trama de metilación (Figura 5). Figura 1. Esquemática CpG metiladas. En la célula normal, el promotor asociado a las islas CpG son en su mayoría no metilados (gris), mientras que los sitios CpG en los órganos de genes son escasos y, en general metilado (rojo). El panel de la derecha se expande la estructura molecularUre de ADN en un sitio CpG individuales y muestra la metilación con una molécula de CH3 en el carbono 5 de citosina. Figura 2. . Químicos esquema de conversión de Análisis de la metilación del ADN consta de cuatro etapas principales que se muestra, la desnaturalización, la conversión de bisulfito, amplificación por PCR y análisis. En el panel derecho, las modificaciones de la molécula de citosina que se producen durante la conversión de bisulfito se muestran. Figura 3. La optimización de la amplificación por PCR. A. Agarosa por electroforesis en gel con un perfil de gradiente de temperatura amplificación por PCR a partir de una mezcla de ADN metilado 50% y no metilado. Los fragmentos se han digerido con Taq1 (T) o HpaIII (H) que digieren el ADN metilado y no el ADN de bisulfito convertidos respectivamente. B. Calor análisis de la curva de disociación muestra una ecuaciónl porcentaje de ADN metilado y no metilado (línea roja mezcla 50/50) en comparación con el control de amplificación completamente metilado (línea rosa, M) y el ADN metilado (línea verde, U), que se disocian en 82,1 ° C y 78,9 ° C respectivamente. Figura 4. Ejemplo de secuenciación directa y un mapa de bisulfito. A. Secuencia de traza a partir de tres líneas celulares diferentes con los sitios CpG resaltado en amarillo. La línea celular de X muestra el 100% de metilación en los tres sitios CpG, mientras que las líneas celulares Y y Z muestran distintos grados de metilación como se ve por la superposición de G / A las señales. B. Representante de bisulfito de mapa que muestra la densidad de metilación (puntos rojos) en los respectivos sitios CpG, según lo determinado por secuenciación directa de los distintos clones. <br /> Figura 5. ADN de alto rendimiento con el análisis de metilación Sequenom. A. Espectro de vista utilizando la tecnología Sequenom epiTYPER. Fragmentos de ADN mostrar espectros específicos, dependiendo de la cantidad presente de la metilación del ADN. B. Epigrama resumen del porcentaje de metilación del ADN en cada sitio CpG de cuatro líneas diferentes de células. La metilación C. resumen de la trama derivada de la Epigrama Sequenom.