마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

1. 셀 라인 U87MG glioma 세포 5 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충 DMEM – F12 대형 조직 문화 flasks에서 양식입니다. 세포 따뜻한 인산과 함께 두 번 flasks 닦고하여 수확 아르 식염수 (PBS)는 버퍼와 37에서 그들을 잠복기 ° 0.25 %의 트립신과 0.05 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 PBS의 10 ML 5 분 C. 일단 세포들은 문화 미디어와 centrifuged (4 분 300 X G) 10 ML을 포함한 50 ML 튜브에 배치되며, 해제됩니다. 세척 후, 세포 10의 농도에 resuspended 아르 X 10 μl 50,000 세포 / 5의 접종에 대한 허용 문화 매체에 6 / ML. 전지는 intracranial 사출까지 얼음에 보관됩니다. 2. 탈당 intracranial 가이드 나사 이 절차는 세포의 주입하기 전에 몇 일 진행하실 수 있습니다. 여기에서 설명한 모든 절차가 엄격한 무균 조건 하에서 실시되었습니다. 생쥐 (BALB / C 뉴 / 뉴 여성, 5-6주, 약 18g), 식별을 위해 번호를 무게와 케타민 (100 MG / kg)와 xylazine (5 MG의 혼합물의 intraperitoneal (IP) 주입과 anesthetised 아르 / kg). 피부는 요오드 솔루션 닦여 있으며 작은 절개 (2~3mm)은 중간선과 interaural 라인 앞쪽에의 오른쪽을 따라 이루어집니다. 이것은 두개골의 코로나와 화살 봉합를 제공합니다. bregma는이 두 봉합의 교차점에 위치합니다. 안내 나사 진입 점은 다음 2.5 mm 수평 및 bregma에 앞쪽에 1mm 지점에서 표시됩니다. 이 시점은 바로 꼬리가있는 핵 위 1에 위치하고 있습니다. 1 X 1mm 깊은 구멍은 경질에 두개골을 통해 트위스트 드릴을 개최 살균 손을 뚫고있다. 경질로 두개골 표면 아래 1.6 mm를 연장합니다 소독 안내 나사는 다음 스크류 드라이버 구멍으로 나올 수있는 두개골 (그림 1A)와 플러시까지. 무균 탐침 또는 스크류 더미는 다음 오프닝 (그림 1B)를 닫습 가이드 나사의 중앙 구멍에 배치됩니다. 상처가 Vetbond 조직 접착제 (N – 부틸 cyanoacrylate)와 생쥐와 함께 닫혀있다는 intraperitoneal reversine의 주입 (작은 동물) (0.1 ML / kg)과 진통제에 대한 carprofen을 (5 mg/kg/100 μl) 제공됩니다. 마우스 그런 다음 20 분 소요될 수 온난 매트 (36 ° C)에서 복구하는 허용됩니다. 그들이 완전히 의식 때까지 마우스가 자주 모니터링하고 복구 시간 동안 관찰됩니다. 3. Intracranial 세포 engraftment 무균 수갑에 채워진 해밀턴 주사기는 가이드 나사 콘센트 (그림 1B) 아래 연장하기 위해 바늘의 단지 2mm을 허용 바늘 끝에 작은 플라스틱 반지를 적용하여 준비가되어 있습니다. 최종 접종 지점 따라서 두개골 표면 아래 3.5 mm입니다. 가이드 나사 수술 다음과 같은 4 일, 마우스는 위에서 다시 anesthetized 아르 (2.1)와 작은 절개는 탐침을 제거하는 가이드 나사를 통해 이루어집니다. 수갑에 채워진 해밀턴 주사기 그러면 어떤 공기 방울을 만들거나 세우하지주의를 복용 잘 혼합 세포의 5 μl로 가득 차 있습니다. 주사기는 재관류 펌프로 확보하고 바늘은 가이드 나사 (그림 1C)에 삽입됩니다. 세포는 다음 시간 30 μl의 속도로 주입됩니다. 자동 장치 (그림 1D)는 우리가 일정한 유량 한 번에 10 동물까지 주입 수있었습니다. 세포도 수갑에 채워진 해밀턴 주사기를 사용하여 수동으로 분사가 될 수도 있고 아니면 다른 방법으로 주사기는 바늘 끝이 2mm로 안내 나사 넘어 확장할 수 있도록 3mm로 손질되어 200 μl 피펫 팁에 의해 수갑에 채워진 수 있습니다. 주입은 다음 일정한 속도로 지속적으로 수행되어야합니다. 주입이 완료되면, 주사기는 신중하게 제거되고 탐침은 가이드 스크류로 대체됩니다. 상처가 닫히고 접착되고 생쥐 (2.7) 이전과 복구 약품을 제공하고 온난 매트에 복구하는 허용됩니다. 4. 치료에 도전 U87MG 세포 접종 후 4 일, 마우스는 무게와 무작위로 제어 및 치료 그룹으로 나누어집니다. 치료 그룹이 AMG102 (PBS 100 μl 100 μg)의 IP 주사를 부여하는 동안 컨트롤 그룹은, PBS (100 μl)의 내부 – 복막 (IP) 주사를 주어집니다. 주사는 14 일 동안 매초마다 6 일 주사 (그림 2)의 총 반복하고 있습니다. 마지막 주사 후, 생쥐는 매일 모니터링 모든 둘째날 무게입니다. 쥐가 중요한 신경 장애 (균형 장애, 마비), 탈수, 또는 이상이 10 % 체중 감소 또는 죽어가는을 표시하기 시작하면, 그들은 편안하게 euthanised되었습니다. 이러한 인도적인 엔드 포인트 일은 다음 카플란 – 마이어 생존 곡선에 기록되었다. 5. 치료 효율 평가 </p> GraphPad 소프트웨어, 샌디에고 캘리포니아 미국, 카플란 – 마이어 생존 곡선은 Windows 용 GraphPad 프리즘 4.03를 사용하여 생성되었습니다 www.graphpad.com 3. 사망 또는 euthanizations는 엔드 포인트 이벤트로 표시 1으로 득점했다. 실험의 끝에 살아 남은 동물이 아닌 이벤트로 기록과 0으로 득점했다. 6. 대표 결과 : 제어 동물 세포의 초기 접종 후 신경학적인 장애와 체중 감소 23일의 흔적을 보여주하기 시작했다. 이것은 크게 35일에 AMG102 대우 그룹에서 지연되었습니다. 실제로 35 일, 77 %는 (N은 = 7 / 9) 제어 그룹의이 euthanized했다. 카플란 – 마이어 생존 곡선은 명확하게 AMG102 치료 (그림 3)에 대한 응답으로 생존에 상당한 증가를 보여줍니다. 일 70에 의해, 컨트롤 마우스의 88 % (N = 8 / 9) 37 %와 비교 euthanized했다 AMG102 취급 그룹 (N = 8분의 3). 두뇌의 Histological 분석 컨트롤 그룹에있는 모든 구 동물 개발 종양은 3 8 AMG102 취급 생쥐 (그림 4)에 비해 것으로 확인되었습니다. 그림 1 : 이미지 (A)는 직접 꼬리가있는 핵 위에있는 지역에 위치 intracranial 가이드 나사를 보여줍니다. 바늘의 2mm는 가이드 초과하고 세포가 꼬리가있는 핵 내부에 3.5 mm를 주입되도록 수갑에 채워진 해밀턴 주사기 (세포와 함께 미리로드)은 다음 가이드 나사 내부에 배치됩니다. 주사기는 나중에 탐침 (B)에 의해 제거 및 교체됩니다. 자동 주입 장치 (C)는 한 번에 10 동물까지 주입 수 있습니다. 오 동시 주사 (D)는 아르 여기 표시됩니다. 그림 2 : 연구 프로토콜의 도식. 세포 치료 일 4 일 시작과 0에 주입했다. 치료 그룹 AMG102 (100 μg/100 μl) IP의 주사를받은 반면 제어 동물은 PBS (100 μl) IP의 주사를 받았습니다. 이 주사는 10 일 동안 매초마다 주어진 일되었습니다. 6 주사의 총 주어진되었습니다. 동물은 다음 신경 및 신체 장애의 흔적을 70 일 동안 감시했다. 그림 3 : 제어 및 AMG102 취급 생쥐를 비교 카플란 – 마이어 생존 곡선. 중요한 생존은 AMG102 (P = 0.005가)와 다음과 같은 치료를 얻은 것입니다. 그림 4 : 제어 동물에서 종양 개발 (A)와 AMG102 치료 동물 튼실한 종양 개발 (B)를 보여주는 코로나 뇌 섹션 Microphotographs. 스케일 바 1mm입니다.