الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا
Summary
وصفت والاثيلين جلايكول المستندة إلى أسلوب التزجيج لأجنة الفئران. فإنه من المفيد إلى أساليب أخرى في بساطتها والسمية الجنينية منخفضة ، وبالتالي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من سلالات من الفئران ، بما في ذلك الفئران الفطرية والجينات المعدلة.
Abstract
الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران هي أساس التكنولوجية التي تدعم علوم الطب الحيوي ، لأنه قد تم إنتاج العديد من سلالات الفئران التي كتبها التعديلات الجينية وعدد يتزايد باستمرار عاما بعد عام. بدأ تطوره التقني مع أساليب التجميد البطيء في 1 1970s ، وأعقب ذلك من خلال طرائق التزجيج وضعت في أواخر 1980s 2. عموما ، والأسلوب الأخير هو مفيد لها في السرعة والبساطة ، والبقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة المسترجعة. ومع ذلك ، فإن cryoprotectants الواردة سامة للغاية ويمكن أن تؤثر على تطور الجنين اللاحقة. ولذلك ، فإن الأسلوب لا ينطبق على سلالات معينة من الفئران ، وحتى عندما يتم تبريد الحلول إلى 4 درجات مئوية للتخفيف من آثار سامة خلال التعامل مع الجنين. في مركز BioResource بتبريد ، تمسك الماوس سلالات أكثر من 5000 مع خلفيات وراثية مختلفة ، والظواهر 3 ، وبالتالي لدينا الأمثل a التزجيج الشركة المصرية للاتصالاتchnique التي يمكننا cryopreserve أجنة من سلالات مختلفة من الفئران ، مع بقاء الجنين فوائد مرتفعة بعد التزجيج والذوبان (أو تسييل ، وأكثر تحديدا) في درجة حرارة الغرفة 4.
هنا ، نقدم أسلوب التزجيج للأجنة الفئران التي تم استخدامها بنجاح في مركزنا. الحل الحفظ بالتبريد يحتوي على غليكول الاثيلين بدلا من DMSO لتقليل السمية للأجنة 5. كما أنه يحتوي على Ficoll والسكروز للوقاية من devitrification والتكيف التناضحي ، على التوالي. ويمكن معالجة الأجنة في درجة حرارة الغرفة ونقل الى النيتروجين السائل في غضون 5 دقائق. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. وصفنا الداخلي أيضا ذوبان الأجنة المزجج بالتفصيل لأنها حاسمة الظريفع لاستعادة كفاءة من الفئران الحية. وهذه المنهجيات تكون مفيدة للباحثين والفنيين الذين يحتاجون إلى الحفاظ على السلالات الماوس لاستخدامها لاحقا بطريقة آمنة وفعالة من حيث التكلفة.
Protocol
Discussion
منذ صدور التقرير الأول من التزجيج الجنين الماوس بواسطة RALL وفاهي 2 في عام 1985 ، أدخلت تحسينات تقنية عديدة لزيادة البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد الذوبان. وقد حققت واحدة من أنجح التعديلات عن طريق استخدام جلايكول الإثيلين باعتبارها cryoprotectant بسبب سميتها المنخفضة والعالية النفاذية غشاء. هذه المزايا تتيح لنا للتعامل مع تجميد الاجنة في درجة حرارة الغرفة (4) ؛ التزجيج أساليب أخرى تتطلب تسليم الجنين في درجات الحرارة وبرودة ليست دائما تنطبق على بعض سلالات من الفئران بما BALB / ج 6. تم تطوير الاثيلين غليكول first التزجيج المستندة إلى كاساي وآخرون. في عام 1990 5،7. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. لذا ، قد يكون أسلوب التزجيج الموصوفة هنا يكون التطبيقlicable إلى العديد من المختبرات باستخدام الفئران كنماذج البحوث. ويمكن أيضا أن تكون نفس الطريقة المستخدمة لأجنة فئران في مراحل morula والكيسة أجنة الفئران 8 و 9. ومع ذلك ، فقد وجدنا مؤخرا أن نوعية cryotubes قد تؤثر على معدلات البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد ذوبان التجميد. وهكذا ، فإنه لا بد من دراسة سطح داخل cryotubes لسلاسة في الأجنة قبل التزجيج (على سبيل المثال ، انظر الجدول في الكواشف محددة والمعدات).
أساليب التزجيج لها مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية التجميد البطيء ، ولكن لديهم أصلا في وضع غير موات بالنسبة لغرض النقل. كما ينبغي أن تبقى في الأجنة المزجج أدناه -120 درجة مئوية للحفاظ على بقائها ، وهي تستخدم عادة لنقل الشحن الجاف بشكل آمن. الشاحنين جافة ثقيلة وضخمة ، ولها ذهابا وإيابا أمر مكلف ، وخصوصا في النقل الدولي. نحن الآن حاليا بتطوير أسلوب التزجيج جديدةوالتي يمكن أن تكون مخزنة في الأجنة المزجج الجليد الجاف في درجة الحرارة (نحو -80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 7 أيام 10. هذا الأسلوب يجب أن يكون التزجيج للجيل القادم.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أجريت هذه الدراسة بالتعاون مع مشروع BioResource الوطني ، وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Bovine serum albumin | Merck Biosciences (Calbiochem) | 12657 | |
| Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries | 031-00435 | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | |
| M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cryotube | Sumitomo Bakelite | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |
Referencias
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
- Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
- Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
- Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
- Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
- Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).
