الفئران الفحص مساريق الأوعية الدموية
Summary
لم تكن طبيعية نسيج أوعية دموية الكبار الثدييات التي تفتقر الأوعية الدموية الفسيولوجية والتي تتعرض لتدخل جراحي يستخدم لدراسة : (ط) بدء وتطوير الأوعية الدموية داخل الصفاق التالية من وكلاء الإدارة الاختبار ، و (ب) تعديل الأوعية الدموية التالية للادارة الشاملة اختيار وكلاء الاختبار.
Abstract
The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; (iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).
Protocol
Discussion
وقد قدم في عام 1986 فحص (3) ولقد تم تطويرها تباعا وصقلها في مختبرنا 7،10-12. كما نوقشت في ورقات الاستعراض (دعوة) 1 ، 2 ، مقايسة يقارن جيدا مع الثدييات الأخرى في مقايسة الأوعية الدموية في الجسم الحي الصدد ولا سيما إلى ميزات هامة مثل النسيج اختبار الكبار أصلا أوعية دموية ويفتقر إلى الأوعية الدموية الفسيولوجية ؛ الحد الأدنى من الصدمة ، إن وجد ، هو لحقت النسيج ؛ تقاس المتغيرات الكمية حقا ، والذي يسمح التحليل الإحصائي السليم بشأن الاستجابة للجرعة والدراسات الجزيئية النشاط ؛ تنتشر الأوعية الدموية يحدث ، وهو غلبة في الأنسجة الطبيعية والأورام ، ويتم تجميع البيانات بسهولة السمية في الفئران التي تنمو بقوة من الناحية الفسيولوجية في مرحلة البلوغ. قد تتضمن ميزات غير ملائم حقيقة أن مقايسة نسبيا تستغرق وقتا طويلا ، وخصوصا عندما تقدير عدد وطول قطاعات microvessel الفردية وبراعم microvessel ، وأنه لا يسمح real-time/serial الملاحظات ، وأنه لا يصلح بالمرة لالفئران منذ العديد من النوافذ المساريقي في الفئران عدم microvessels الأصل المحتملة من الشعيرات الدموية الجديدة التي يمكن أن تنشأ.
هي ، في الوقت الحقيقي الملاحظات ومع ذلك ، تمكين بواسطة المجهر intravital حيث مفلطحة النوافذ سليمة المساريقي exteriorized لكن على مدى مرحلة المجهر بينما الحيوان هو تخدير ، كما نوقش في 1.
وقد تم تحقيق تقدم كبير في مجال البحوث الأوعية الدموية في العقود الماضية باستخدام نماذج مثل micropocket القرنية ، والغشاء فرخ مشيمائي ، والمقايسات SC Matrigel المكونات ، والتي هي أدوات مفيدة لكنها محدودة في نهاية المطاف. التطبيقات السريرية في المستقبل من العلاجات المضادة للعائية وعائية الموالية – يستلزم إنشاء والتحقق من صحة أكثر حساسية وأهمية من الناحية البيولوجية ، ونماذج ما قبل السريرية الكمية حقا ، مثل تلك التي وصفها في التقرير الحالي.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدمت الدعم المالي لمعظم الدراسات التي أجراها مجلس البحوث الطبية السويدية (منحة 5942).
Materials
Buffers and reagents
0.5 M Tris-HCl (pH 7.8) stock solution
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (60.57 g) is dissolved in ~900 ml aqua dest and ~45 ml of 25% HCl (concentrated) is added to achieve pH 7.8 followed by dilution to 1 liter with aqua dest.
Tris-buffer saline (TBS; pH 7.8)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.8 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
TBS (pH 7.4)
To 200 ml of the stock solution is added 18 g NaCl dissolved in dissolved in ~1800 ml aqua dest with adjustment of pH to 7.4 using the stock solution, followed by dilution to 2 liter with aqua dest.
Trypsin solution (0.05% trypsin, 0.1% CaCl2)
Contains 0.1 g trypsin and 0.2 g CaCl2 in 200 ml TBS (pH 7.8).
Sucrose solution 2.5%
Contains 5 g sucrose in 200 ml TBS (pH 7.8).
Stock solution of 1% Sodium azide in TBS (pH 7.4)
Contains 1 g Na-azide in 100 ml with TBS (pH 7.4).
Diluting buffer: 0.1% BSA, 0.01% Na-azide
(Used to dilute antibodies in the Vectastain ABC kit). Contains 0.1 g bovine serum albumin (BSA) and 1 ml of 1% Na-azide, diluted to 100 ml with TBS (pH 7.4).
ABC kit Vectastain PK 4002, ABC peroxidase mouse IgG
Normal horse serum; blocking serum; yellow solution: 3 drops/10 ml dilution buffer.
Biotinylated antibody; anti-mouse IgG; blue solution: 1 drop/10 ml dilution buffer.
ABC-reagent: orange solution, 2 drops plus brown solution 2 drops/10 ml TBS (pH 7.4).
Mix these solutions 20 minutes before use!
Mouse (monoclonal) anti-rat endothelium(Biosource International, Camarillo, CA, U.S.A.)
| Catalog # | ARU0181 |
| Clone # | MRC OX-43 |
This antibody is directed against all vascular endothelial cells in the rat, with the exception of those in the brain.
Vectastain peroxidase Avidin Biotin Complex (ABC) kit
The kit contains primary antibody, biotinylated secondary antibody, avidin-biotinylated enzyme complex (ABC), and enzyme substrate. See www.vectorlabs.com or www.immunkemi.se for protocols.
Bovine serum albumin(BSA) (Sigma-Aldrich, catalog # A-4503).
DAB= 3,3′-Diaminobenzidine Isopac (Sigma-Aldrich, catalog # D 9015).
Trypsinfrom Bovine Pancreas (Sigma-Aldrich, catalog # T 4665).
Vectastain peroxidase ABC-kit, Mouse IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Sweden)
Referencias
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
- Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).
- Norrby, K., Jakobsson, A., Sorbo, J. Mast-cell-mediated angiogenesis: a novel experimental model using the rat mesentery. Virchows Arch. B Cell. Pathol. Incl. Mol. Pathol. 52, 195-206 (1986).
- Norrby, K. Mast cells and angiogenesis. APMIS. 110, 355-371 (2002).
- Albertsson, P., Lennernas, B., Norrby, K. On meteronomic chemotherapy: modulation of angiogenesis mediated by VEGF-A. Acta Oncol. 45, 144-155 (2006).
- Norrby, K. Human apo-lactoferrin enhances angiogenesis mediated by vascular endothelial growth factor A in vivo. J. Vasc. Res. 41, 293-304 (2004).
- Norrby, K., Mattsby-Baltzer, I., Innocenti, M., &, T. u. n. e. b. e. r. g., S, . Orally administered bovine lactoferrin systemically inhibits VEGF(165)-mediated angiogenesis in the rat. Int. J. Cancer. 91, 236-240 (2001).
- Norrby, K. Low-molecular-weight heparins and angiogenesis. APMIS. 114, 79-102 (2006).
- Norrby, K., Nordenhem, A. Dalteparin, a low-molecular-weight heparin, promotes angiogenesis mediated by heparin-binding VEGF-A in vivo. APMIS. 118, 949-957 (2010).
- Norrby, K. Basic fibroblast growth factor and de novo mammalian angiogenesis. Microvasc. Res.. 48, 96-113 (1994).
- Norrby, K. Vascular endothelial growth factor and de novo mammalian angiogenesis. Microvasc. Res. 51, 153-163 (1996).
- Norrby, K. Microvascular density in terms of number and length of microvessel segments per unit tissue volume in mammalian angiogenesis. Microvasc. Res. 55, 43-53 (1998).
